Вы вошли как Гость
Текущая дата: Четверг, 2024-04-25, 10:27 PM
|
Проводка и заливка
|
|
| Maxim | Дата: Пятница, 2010-07-23, 3:27 PM | Сообщение # 136 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Vladpatholog!
Я очень рад, что у Вас идет движение к лушчему и есть первые результаты.
В отношении проводки мы с Буэсой в статье статистически показали, что разницы между ИПА+масло и ацетон - уайт-спирит нет.
Буэса также показал в своей работе, что при сравнении спирт-ксилола и ИПА-этанол-масло также никакой разницы статистически не выявлено.
В отношении депарафинирования также мы не нашли статистических отличий между традицонными способами депарафинирования и мыльным раствором.
Вся разница в безопасности для персонала, окружающей среды, дешевизне и некотром упрощении методов.
Что касается этапов после эозина: дистиллированная вода - промыть и далее сушить в термостате до полного высыхания. Обычно достаточно 5-10 минут. Затем заключение. Никаких растрескиваний, мути и серого песка быть не должно. Пробуйте смело.Добавлено (2010-07-23, 3:27 PM)
---------------------------------------------
Перекрас при окраске в партиях бывает как и недокрас одианоково часто. Мы обычно окрашиваем по 20-25 стекол одновременно. Есть срезы толще и тоньше. Обычно ориентируются либо на тонкие, либо на толстые срезы. Главное - четко отдифференцировать гематоксилин.
Еслииспользуется прогрессивная формула, например Mayer, тогда перекраска не наступает и дифференцировка не нужна. Это один из вариантов выхода.
Другая трудность - отмывка эозина. В толстых срезах его больше и вымывается оттуда дольше. Поэтому тонкие срезы будут бледнее. Тут рецептов нет - по одному стеклу никто возиться нет смысла, особенно если в день красится партий 30-40. Поэтому надо стараться получить одинаковую толщину. Это стандартизация вырезки, фиксации, проводки и микротомии. Все это привести в порядок очень сложно и трудно, но можно при овместных усилиях всех сотрудников. Vladpatolog, а этот срез (из ответа №126) был проведен с ксилолом или с маслом?
И еще один вопрос: а для чего такое количество ксилолов и спиртов в батарее для окраски? Как часто все это меняется, после скольки стекол выливаются первые реагенты?
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Пятница, 2010-07-23, 3:45 PM | Сообщение # 137 |
 Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| этот срез выполнен с маслом и изопропанолом. депарафинизация фэйри. Фокус с фэйри вообще на ура шел.
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Пятница, 2010-07-23, 3:46 PM | Сообщение # 138 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| А ксилолы в конце и карбол-ксилол, лаборанты относят к просветлению. Я говорю - уберите ксилолы вообще со стола, а они смотрят и не понимают. Утверждают, что они просто необходимы.
______________________
Они считают, что после эозина просто необходимо все эти ксилолы пробежать.
____________
Как часто смены идут не интересовался.
И вот еще вопрос вопросик: что все-таки после эозина? Т..е. у нас так -( эозин)-(вода)-(спирт1)-(спирт2)-(спирт3)-(спирт4)-(спирт5)-(спирт+фенол+ксилол)-(карбо+ксилол)-(карбол+ксилол)-(ксилол1)-(ксилол2)-(ксилол3) -(ксилол4)-(покрываем)-(сушим).
Что лишнее?
Максим, вот еще тезис из вашей статьи: Quote 6. После окраски перед заключением удаляют лишнюю воду...
Т.е., что - после эозина сполоснуть в воде и сушить - потом полистерол? А они не "скукошатся" пока сушу их?
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Пятница, 2010-07-23, 7:25 PM | Сообщение # 139 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Vladpatholog) Т.е., что - после эозина сполоснуть в воде и сушить - потом полистерол? А они не "скукошатся" пока сушу их?
Вот-вот. Я так когда-то делал, чтобы окраску по Гимзе, чувствительную к спирту, не испортить (сушил минут 15 на воздухе). Смотреть можно, но скукоживание нежных структур было.Добавлено (2010-07-23, 7:25 PM)
---------------------------------------------
Впрочем, давайте не будем рассуждать - а просто попробуем. Одно-два испорченных (да и то - не испорченных, а лишь несколько худшего качества) стекол, и то, даже в самом плохом случае того стоят. Может, после фейри и при просушке в термостате все получается лучше.
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Пятница, 2010-07-23, 7:40 PM | Сообщение # 140 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Хорошо бы если Maxim, все же разместил фото как выглядят срезы после этакой сушки, но про фэйри я тоже не верил - а оно очень даже работает...может и здесь зря я сомневаюсь.
Мне вот важно - после эозина, что Максим делает потом - вода и сушить что-ли? Или все же есть спирты?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2010-07-23, 8:13 PM | Сообщение # 141 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| после эозина сполоснуть водой и сушить в термостате 5-10 минут. Никакого спирта или чего-то еще. Полистирол одновременно просветляет и консервирует.
Немного теории о том, почему мы видим окрашенные струткры и для чего кислол напишу чуть позже. Пока прилагаю фото.
10%NBF, ИПА-масло, фэйри - сушка в трмостате - полистирол.
Пока эти фотографии. Поищу еще.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2010-07-23, 8:21 PM | Сообщение # 142 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Выше фото плаценты и метстаз рака молочной железы в лимфоузел. Окраска ШИК-альциановый синий х100. Ниже - миокард аутопсийный и почка. Я специально даю большие увеличения.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2010-07-23, 8:55 PM | Сообщение # 143 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| А вот еще пара фото, которые прислал Tony Henwood из Австралии. Он депарафинировал с ксилолом и без. Это минадилна, bcl-6 срезы с одного блока. Добавлено (2010-07-23, 8:55 PM)
---------------------------------------------
В рутине мы пока еще не готовы использовать метод с фэйри. поскольку для того, чтобы затеваться с ним, нужна баня, в которой будут греться 4-6 емкостей для стоек со стеклами. Менять-то нужно через 2 партии, а у нас ежедневный поток более 30 партий.
Другое делов том, что у нас толстые стекла - толщиной 2 мм. Они подписаны тушью, так как нет матового края и тушь хорошо смывается водой и мыльными растворами. Нам нужно купить примерно 90 000 тонких стекол со шлифованным краем для работы в течение года. И водяную баню. Тогда программно перейдем. Когда делаю ИГХ я провожу мелкие партии через фэйри или когда есть партия гистохимии - для них у меня имеются тонкие стекла. А праллельно пользоваться и тем и другим методом смысла нет: или убирать все вредное со стола или не затеваться.
Кстати, окончательное обезвоживание высушиванием пригодно не для всех гистохимических окрасок. Часть методов все же требует обезвоживания ацетоном, посольку здесь заканчивается дифференцировка.
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Пятница, 2010-07-23, 8:57 PM | Сообщение # 144 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Фото довольно убедительные, однако, жаль, что нет миокарда с ксилолом с того же блока. Что мне не нравилось при простом высушивании - что в таких тканях, типа миокарда, пространства между клетками были намного больше (ощущение отека интерстиция), а лейкоциты в подслизистой кишки при колите выглядели как сдувшиеся воздушные шарики (или сушеные яблоки).
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Суббота, 2010-07-24, 12:29 PM | Сообщение # 145 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| С депарфинизацией не согласен - если есть хоть какая-то возможность, пусть даже частично уменьшить экспозицию нашего носа с ксилолом - нужно это делать. На счет простого высушивания после эозина - попробуем, посмотрим. Вопрос еще по депарафинизации. С bcl-6 понятно, там и температурное восстановление антигенов и pH9,0, но для ИГХ - ряд антител исключают использование высокотемпературных методик выявления антигенов (у нас ретривер для этих целей), а пропускание через фэйри предполагает, что раствор в общем довольно горяченький (пусть и время небольшое) - дак вот мы не разрушим нужные антигены?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2010-07-24, 5:36 PM | Сообщение # 146 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Температурная обработка при депарафинировании не должна повредить антгиенам, восстанавливаемых ферментами.
Tony Henwood сообщил мне, что он сравнивал депарафинирование 51 антитела, среди которых были:
Alpha Fetoprotein (ZSA06),
CD 34 (QBEND10)
CD 68 (PG-M1)
Keratin (Broad Spectrum) (AE1/AE3)
Keratin (Low Molecular Weight) (5D3)
Neuroblastoma (NB84a)
AFP лучше выглядел после депарафинирования мыльным раствором, в остальных случаях интенсивность окраски была эквивалентной. Все перечисленные антитела требовали ферментного восстановления антигенов. Статья находится в печати.
В любом случае, все нужно пробовать на контрольных стеклах, а потом сравнивать пары стекол слепым методом, тогда все станет понятно.
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Четверг, 2010-07-29, 2:09 PM | Сообщение # 147 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Чакона) Фото довольно убедительные, однако, жаль, что нет миокарда с ксилолом с того же блока. Что мне не нравилось при простом высушивании - что в таких тканях, типа миокарда, пространства между клетками были намного больше (ощущение отека интерстиция), а лейкоциты в подслизистой кишки при колите выглядели как сдувшиеся воздушные шарики (или сушеные яблоки). Quote (С.А.Бобович. К вопросу о патолого-гистологических изменениях внутрисердечных ганглий, М., 1901, стр.47 ) Срез освобождался от парафина при помощи Ol.therebintini и xyloli в равных частях, обжимался пропускной бумагой и обливался б ы с т р о абсолютным алкоголем. Если алкоголь наливать недостаточно быстро, срезы высыхают вследствие испарения растворяющей смеси, и получается сморщивание клеток. Точно также облитые алкоголем срезы необходимо отжимать пропускной бумагой и б ы с т р о переносить в воду; без этой предосторожности на препаратах получаются сморщенныя клетки и искусственныя "перицллюлярные пространства" [....] Когда дифференцировка [в спирт-анилиновой смеси после окраски по Нисслю - Чакона] окончена, срезы необходимо сильно отжать пропускной бумагой и быстро налить Ol.cajeputi. Быстрое обливание необходимо опять-таки необходимо во избежание сморщивания нервных клеток. |
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2010-07-29, 4:43 PM | Сообщение # 148 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Вчера еще раз спецально повторил высушивание срезов после эозина. Никаких сморщиваний лимфоидных элементов и серого песка. Все отлично видно.
|
| |
| |
| Roman | Дата: Воскресенье, 2010-08-15, 11:02 PM | Сообщение # 149 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Попробовал сушку после эозина и заключение в полистирол - все хорошо. Главное лаборанты заинтересовались, но тень сомнения осталась у них. Вот теперь нужно убедить депарафинировать в моющем средстве и проводить без хлороформа.
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Воскресенье, 2010-08-15, 11:09 PM | Сообщение # 150 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Я показывал этот метод многим лаборантам из других лабораторий, когда они приезжали к нам на стажировку. Последний раз это было на прошлой неделе. Обычно сомнения больше возникают на этапе обезвоживания и просветления перед заключением. А вот депарафинирование обычно вызывает восторг и воспринимается на ура. Сама идея кажеся безумной на фоне всех этих ксилоов, уайт-спиритов и т.д. Покажите один раз и в память это врежется навсегда. А когда прийдут к использованию, это уже вопросы другие.
|
| |
| |
|
|
