Вы вошли как Гость
Текущая дата: Четверг, 2024-04-25, 2:48 PM
|
Проводка и заливка
|
|
| Vladpatholog | Дата: Понедельник, 2010-08-16, 7:02 AM | Сообщение # 151 |
 Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Quote Вчера еще раз спецально повторил высушивание срезов после эозина. Никаких сморщиваний лимфоидных элементов и серого песка. Все отлично видно.
А у меня все равно не получается лимфоидную ткань сразу после эозина бех ксилолов покрывать. Все "скукошивается". Покажите снимки пожалуйста. Чего мы не так делаем? А процесс окраски ГЭ не поленитесь написать по этапам - может там чего не так или не с тем делаем?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2010-08-16, 5:37 PM | Сообщение # 152 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Ниже подробный проткол депарафинирования без ксилола, окраски Г-Э и обработки срезов перед заключением без ксилола и спиртов.
Фиксация ВЫРЕЗАННЫХ кусочков (толщиной 2-3 мм) не менее 24 часов при комантной температуре или 18 часов при 37оС (термостат).
Проводка, заливка, микротомия. Срезы должны быть не толще 4 мкм. Чем толще срез - тем труднее сохранить нормальную архитектонику ткани и морфологию клеток. Срезы собирать в дистиллированной воде на предметное стекло с яичным белком, хромовоквасцовым адгезивом, поли-L-лизином, плюс-стекла, замороженные и т.п.
Срезы аккуратно промокнуть влажной чистой салфеткой или фильтровальной бумагой для удаления избытка влаги. Сушить вертикально в термостае 60оС 30-40 мин (или до утра при комнатной температуре, а утром в термостате 60оС 30 мин.).
Протокол окраски:
1. 1.7-2% водный раствор жидкого детергента при 80-90оС 1 минута
2. 1.7-2% водный раствор жидкого детергента при 80-90оС 1 минута
4. Промывали в проточной воде при 90оС 30 секунд.
5. Вторая смена проточной воды при 90оС 30 секунд.
5. Дистиллированная вода комнатной температуры 30 секунд (можно оставить на долгий срок).
6. Гематоксилин квасцовый регрессивный (с дифференцировкой) 3-5-10 минут (как рекомендовано в рецепте).
7. Сполоснуть в дистиллированной воде (5-10 маканий).
8. Дистиллированная вода 1 минута.
9. 0.25% водный раствор соляной кислоты 5-20 маканий. Количество маканий зависит от толщины среза и подбирается опытным путем после первых срезов.
10. Дистиллированная вода 5-10 маканий. Этот этап выполнять сразу после предыдущего и перенести стекла в подщелоченную воду (или 1-2 капли на 250-300 мл воды) или любой буфер с рН 7-8 и >. Ядра должны быть синие, а фон бесцветный.
11. Перенести в дистиллированную воду на 1-3 минуты (лучше 2 смены), чтобы приблизить рН срезов к нейтральному или слабокислому значению. Щелочная рН ослабляет окраску эозином.
12. Окраска эозином как рекомендуется для красителя 30 сек - 1 мин или более. Необходимое время подбирается опытным путем.
13. Дистиллированая вода 10-30 маканий, пока не уйдет избыток эозина со срезов. Первые стекла контролировать под микросокопом. Если эозина еще много, можно даже окунуть 1-2 раза в подщелоченную воду, затем промыть в дистлиррованной воде.
14. Сушить стекла вертикально в термостате 5-10 минут. Срезы должны быть полностью сухими.
15. Капнуть каплю заключающей среды на срез и заключить под стекло.
"Скукоживание" срезов происходит оттого, что срезы толстые или плохо фиксированные. Перекрестные связи формалина достаточно прочные и позволяют выдержать подобные смены температур и воздействие растворителей. Если фиксация недостаточна - начинаются нарушения структуры.
В приложении 2 фото. Фиксация формалин, проводка изорпопанол-масло, депарафинирование и заключение без ксилола, Г-Э.
Малое увеличение - фрагмент лимфоузла толщиной 5 или 6 мкм.
Среднее - метастаз рака молочно железы в л/у.
Насколько скукожены клетки - судить Вам. Все срезано на микротме МС-2, выпуска 1982г, ремонтированном несчетное количество раз. Другого у нас нет. Другие лаборатории получают с наших блоков более тонкие срезы без проблем - у них есть и Leica и Microm с водяной дорожкой.
Этот протокол не выявил диагностических отличий от обычного депарафинирования и просветления с ксилолом при слепой оценке 33 пар стекол 7 патологами дважды с перерывом в 1 месяц.
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Понедельник, 2010-08-16, 6:33 PM | Сообщение # 153 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Ну что - выхожу из отпуска и вновь за проводку сажусь - явно где-то прокол у нас. нас снимках все ОК вроде. Может и правда не досушили.
Спасибо.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2010-08-16, 7:29 PM | Сообщение # 154 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Когда будете анализировать, начните с толщины кусочков на вырезке (2-3 мм), времени фиксации в 10% NBF (24 часа). Для гарантии вырезанные кусочки держите не меньше 24 часов в формалине. Затем промывка в воде и проводка. Промывка в воде нужна. Даже за эти 20-30 минут в проточной воде достатчно для удаления избытка фосфатов из буфера, которые могут затруднить микротомию. Если расписание проводки и реактивы в порядке - проблем быть не должно.
Эти первые этапы очень сильно влияют на качество срезов и качество ИГХ. Никакой, даже самый квалифицированный лаборант не сможет получить классные срезы с кусочков ткани, если они вырезаны толще 3 мм или фиксированы меньше 24 часов. Как правило это недооценивается ни лаборантами, ни врачами. Эти простые геометрические (3мм) и химические (24 часа для завершения химической реакции фиксации) ограничения существенно влияют на дальнейшее качество всех этапов гистологической техники.
Надеюсь, это поможет.
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Четверг, 2010-08-26, 4:28 AM | Сообщение # 155 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Maxim) Промывка в воде нужна. Даже за эти 20-30 минут в проточной воде достатчно для удаления избытка фосфатов из буфера, которые могут затруднить микротомию. Истинная правда... А если материал хранился в забуференном формалине ГОД (такое бывает, поверьте) - то приличных препаратов без многодневной (7 дней) промывки не получить. Добавлено (2010-08-24, 0:20 Am)
---------------------------------------------
Сегодня вышла первая большая серия, проведенная через "вонючий" (такой пришел из Химмеда...) изопропанол, который был заправлен в обычный лейковский аппарат для проводки. Лаборантка говорит, что режется хорошо. Правда, обнаружился существенный минус - лейковский аппарат не предполагает герметичности (даже наоборот), поэтому запах... Добавлено (2010-08-26, 4:25 Am)
---------------------------------------------
Так вот, сравнивая качество срезов с вонючим и с одеколоноподобным изопропанолом, я пришел к выводу... Нет, ребят, я лучше буду переплачивать, но зато буду твердо уверен в высочайшем качестве срезов и без кршачьей вони в лаборатории... Короче, проводка через вонючий спирт хотя и повыше будет, чем этаноловая, но все же эти срезы не идут ни в какое сравнение с тем идеалом, который я получал на беззапаховом реактиве! Добавлено (2010-08-26, 4:28 Am)
---------------------------------------------
Да, а Фейри у нас не пошел - лаборантке лень каждый раз греть раствор: у нас же аутостейнер... Заправила стекла - и может на полчаса уйти в другую комнату - резать блоки... Что ей этот ксилольный запах.
|
| |
| |
| ludvik | Дата: Среда, 2010-09-22, 11:13 AM | Сообщение # 156 |
|
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 34
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги! Вопрос касается наступившего похолодания( проводка вручную) : можно ли поставить последний изопропанол с материалом в термостат 37 град на какое-то время перед переносом в 1-й парафин 60 град ( при переносе из изопропанола комнатной температуры материал затвердевае)?.
Спасибо
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Среда, 2010-09-22, 1:14 PM | Сообщение # 157 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Можно, конечно!
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Среда, 2010-09-22, 5:28 PM | Сообщение # 158 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Ludvik!
Я бы даже перенес последний изопропанол на 30-40 минут в термостат 45-50оС. Только нужно закрыть крышкой банку плотно, чтобы не испарялся изопропанол. Мы пользуемся евробанками (широкое горло и завинчивающася металлическая крышка).
В приложении фото наших батарей для проводки.
Как я понимаю, Вы пользуетесь методом с изопрпанолом и парафином? Делаете ли промежуточную смесь изопропанол:парафин 1:1 (термостат 60оС)?
|
| |
| |
| Roman | Дата: Среда, 2010-09-22, 10:29 PM | Сообщение # 159 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| я все таки не понимаю. вначале обсуждался метод изопропанол-минеральное масло-парафин
а существует еще и метод без масла и сразу из изопропанола в парафин? для каких тканей этот метод применим? и если можно какой его протокол? и что все таки предпочтительней с точки зрения качества и экономии времени?
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2010-09-23, 6:17 AM | Сообщение # 160 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Roman!
Самый первый был описан метод ЮА Криволапова с изопропанолом и парафином. Этот метод исползуется в некоторых лабораториях. Я только не уверен, что добавляют Triton X100, как это рекомендовал автор.
Тем не менее, я слышал, что метод нравится не всем и люди все еще ищут альтернативу.
Вообще же методов проводки есть столько, сколько существует лабораторий, поскольку всегда можно найти ккие-то отклонения в каждом протоколе.
Метод с изопропанолом и минеральным маслом в том виде, как он описан здесь, сейчас применяется в трех российских лабораториях, а также в двух американских, двух канадских и одной шоттландской лабораториях. Многие лабораториии начинают пробовать, но об кокнчательных решениях не сообщают. Видимо, есть какие-то трудности, и люди пасуют перед ними.
Если нужна поддержка, я готов помочь в любом варианте (Maxim_71@mail.ru). Боьшинству лабораторий для запуска метода с маслом было достаточно прочесть проткол и задать пару вопросов по интернету, другие приезжали и смотрели. Однако, те, кто попробовал метод с маслом уже не переключаются на другие методы. Были случаи, когда начали работать с маслом, затем перешли на изопропанол-парафин, однако их хватило не надлого - одна лаборатория через полгода вернулась к маслу. У нас тоже были сбои в снабжении и мы пару раз возвращали свой старый метод с уайт-спиритом и ацетоном - и с радостью возвращались к новому. Экономия времени и качество в проводке - это две противоположности, если у Вас нет средств для покупки вакуумного процессора (как и у меня). Однако, еще есть много других факторов, от которых зависит проводка и еще есть факторы, от которых проводка не зависит, но из-за них быстрее осуществлять работу лаборатории в потоке невозможно. Об это сказано в статьях по продуктивности и уровням для пероснала гистологических лабораторий (они есть в каталоге файлов).
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Четверг, 2010-09-23, 11:37 AM | Сообщение # 161 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Roman, про маслянный метод можете забыть, если у Вас автоматическая проводка - обычно аппараты для нее совершенно не годятся - в них не предусмотрено соответствующего числа подогреваемых ванн.
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Четверг, 2010-09-23, 1:24 PM | Сообщение # 162 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Метод с маслом в полной мере удовлетворяет и испльзуется в ИГХ-лаборатории. Пока переход на этот метод всех подразделений не произошел (но это видно моя вина - надо настойчивее быть), лишь небольшая часть материала ведется через этот метод, когда не предполагается ИГХ, обычно когда результат нужен превосходный и время критично.
|
| |
| |
| ludvik | Дата: Четверг, 2010-09-23, 3:23 PM | Сообщение # 163 |
|
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 34
Статус: Offline
| Quote (Maxim) Как я понимаю, Вы пользуетесь методом с изопрпанолом и парафином? Делаете ли промежуточную смесь изопропанол:парафин 1:1 (термостат 60оС)? Да, мы перешли на изопропанол-парафин. На ткань - 9 спиртов, 3 парафина ( все парафины в 60 град). Промежуточной смеси не делаем.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2010-09-23, 6:14 PM | Сообщение # 164 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Vladpatholog!
Quote (Vladpatholog) Метод с маслом в полной мере удовлетворяет и испльзуется в ИГХ-лаборатории
Значит, я добавляю Вашу лабораторию в список пользователей метода изопропанол-минеарльное масло? Roman!
Quote (Чакона) Roman, про маслянный метод можете забыть, если у Вас автоматическая проводка - обычно аппараты для нее совершенно не годятся - в них не предусмотрено соответствующего числа подогреваемых ванн
Чакона совершенно прав. Наш путь был такой. Мы сначала избавлились от марли и купили кассеты (мы пользуемся ими многоразово. Да, мне стыдно, но, но пока так.). Результаты стали заметно лучше, чем с марлей. В стакан для АТ-4 влазит только 11-12 кассет. Было у нас 3 аппарата АТ-4. Убралиих из лаборатории и стали пользоваться вручную литровыми банками с ацетоном и уайт-спиритом. Стало гораздо лучше, чем со спиртом и ксилолом или хлороформом. Потом добавили один термостат, увеличили количество банок и перешли на изопропанол-масло. стало немного лучше. Когда через полгода был перебой с поставкой изопропанола, на 3 дня вернулись к уайт-спириту. Стало значительно хуже, чем с маслом. Особенно отвыкли от запаха. Вернулись к маслу и все стало хорошо. Ludvik!
А почему так много изопропанола в батарее для проводки? Обычно достаточно 5 или 6 смен спиртов.
И 3 парафина как-то маловато на мой взгляд при постоянном потоке. А какой у Вас график смены спиртов и парафина? Через сколько кассет/кусочков? Просто интересно.
|
| |
| |
| Roman | Дата: Четверг, 2010-09-23, 11:39 PM | Сообщение # 165 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Спасибо всем за отклик. В нашем отделении автомата для проводки нет и не предвидится так что сам Бог велел перейти на изопропанол-масло-парафин. Правда нет и кассет (мы это уже обсуждали). Можно ли испытать метод в марлевых узелках?
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
|
|
