Вы вошли как Гость
Текущая дата: Четверг, 2024-04-25, 4:06 PM
|
Проводка и заливка
|
|
| Karen | Дата: Суббота, 2012-02-04, 1:43 PM | Сообщение # 286 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Quote (Maxim) недообезвоженных кусочков ...будут везде заметны длинные продольные щели по ходу коллагеновых волокон
Кстати да, проблема знакома, некоторые образцы у меня так и резались, слой эпителия местами отделялся от слоя соединительной ткани. Я, наоборот думал что пересушил, потому что это были совсем мелкие образцы (2мм) проведенные по обычному (не сокращенному) расписанию?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2012-02-04, 1:52 PM | Сообщение # 287 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Да, так и есть.
Смысл пропитывания парафином состоит не только в том, чтобы ткани заключить в нейтральную плотную среду, в которой прекращаются химические реакции. Твердый парафин призван обеспечивать поддержку тканей во время микротомии. И если пропитывание внутри кусочка будет недостаточным, то ткани будут сморщиваться, а при попадании на поверхность воды гидрофобные участки будут насыщаться водой, и в результате слои параина просто оотлкунтся от непропитанных структур и возникнут щели. Коллагеноые волокна и ткани, богатые клетками очень хорошо иллюстрируют это.
|
| |
| |
| Karen | Дата: Суббота, 2012-02-04, 2:41 PM | Сообщение # 288 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Quote (Maxim) Да, так и есть.
Максим, "так и есть" это в смысле не до конца обезводил или, наоборот, пересушил?
Очень сомневаюсь, что те кусочки были недостаточно обезвожены (2мм, 5 смен ИПА по часу в каждом, как я делал до Вашего совета сократить время кардинально для маленьких экземпляров).
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2012-02-04, 3:08 PM | Сообщение # 289 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Quote (Karen) "так и есть" это в смысле не до конца обезводил или, наоборот, пересушил?
"Так и есть" я имел в виду что щели появляются от недостаточного обезвоживания, а оно тяент за собой плохое пропитывание.
У Вас есть 2 типа объектов: маленькие и большие.
Мне трудно дстиационно понять, в чем дело. Давайте попробуем для маленьких объектов сделаем так Попробуйте укоротить время обезвоживания (сначала до 30 минут, потом до 20) для малых объектов и оценить разницу. Если все будет как прежде, то попрбуйте оставить время обезвоживания прежним и сократите время в парафинах до 4 х 30 минут. Изменяйте только одну позицию, пока не станет понятно, куда двигаться. Это натолкнет на мысли по работе с большими объектами.
Еще думаю, что отслойка эпителия актиний может быть от очень слабых связей поверхностных клеток с рыхлой мезоглеей. Такую вещь мы наблюдаем в базалиомах (опухоли кожм) - в них очень слабы связи опухолевых клеток с окружающей тканью и и пракически всегда видны артефициальные щели. Это даже своеобразный диагностический критерий для базалиом.
|
| |
| |
| Pesikot | Дата: Четверг, 2012-02-09, 7:54 PM | Сообщение # 290 |
|
Рядовой
Группа: Проверенные
Сообщений: 6
Статус: Offline
| Maxim! Помогите пожалуйста! Не очень хорошо получается у меня. Масло заменила на И-20А, смешивается хорошо, температура 50С. Подскажите, если в почке крысы в блоке на срезе вокруг дуговых сосудов белесая ткань, это пересушка и недообезвоживание? Я не понимаю. Изменяла время в спиртах, но на всех блоках более и менее такая картина. Почка хуже всего получается.
Quote (Maxim) Смысл пропитывания парафином состоит не только в том, чтобы тани заключить в нейтральную плотную среду, в которой прекращаются химические реакции. Твердый парафин призван обеспечивать поддержку тканей во время микротомии. И если пропитывание внутри кусочка будет недостаточным, то ткани будут сморщиваться, а при попадании на поверхность воды гидрофобные участки будут насыщаться водой, и в результате слои параина просто оотлкунтся от непропитанных структур и возникнут щели.
Это из-за этого у меня уже на стекле образуются щели, хотя режется блок хорошо и срез в воде хорошо расправляется? Лезвия одноразовые. И еще вопрос, совсем глупый, наверное, но у меня опыт небольшой, если орган полнокровен, для его обезвоживания требуется большее время?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2012-02-09, 8:03 PM | Сообщение # 291 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Pesikot!
Почки - это один из самых непритязательных объектов в гистологии. Им не нужно длительное обезвоживание.
При применении смесей помните, что в них также идет и обезвоживание и пропитывание одновременно.
Не совсем понял о каких сосудах иет речь (было бы хорошо глянуть на фотку, если можно).
Фиксация какая у вас (время, фиксатор, реактив, толщина блока при вырезке)?
А также температура плавления парафина для проводки, заливки и температура воы для срезов?
Для полнокровных органов нужно меньшее обезвоживание. Это болезни всех соскобов и селезенок - кровь выкрашивается. Нужно смочить блок водой 1 мин, удалить избыток марлей и сразу делать тонкие срезы. Первые 3-4 среза будут хорошими. Потом снова нужно будет смачивать.
|
| |
| |
| Pesikot | Дата: Четверг, 2012-02-09, 11:14 PM | Сообщение # 292 |
|
Рядовой
Группа: Проверенные
Сообщений: 6
Статус: Offline
| Maxim! Я имею в виду сосуды между корковым и мозговым веществом почки. На выходных сфотографирую сами блоки, выложу. Фиксация формалин, почки целиком фиксирую, да и другие органы часто тоже целиком, в большом объеме формалина, по времени несколько дней, потом вырезаю куски 3 мм. Эти куски уже в кассету складываю за день до проводки и опять в формалин (время экомлю, чтобы с утра быстро промыть и кинуть в проводку, да и на всякий случай, если недостаточная фиксация была). Парафин гистовакс, водяная баня с 40 градусами (из биовитрума), заливка при помощи машины (опять же таки биовитрум), проводка ручная.
Quote (Maxim) Это болезни всех соскобов и селезенок - кровь выкрашивается.
Это выясняется только при окрашивании? А с блоком что в этом случае? Какая поверхность среза?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2012-02-10, 6:39 AM | Сообщение # 293 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| "Выкрашивается" - высыпается мелкими красно-коричневыми крошками в процессе микротомии из среза. Поверхность среза получается дырками. Это все от избыточного обезвоживания. Сама по себе кровь вообще очень быстро проводится, ей времени для проводки достаточно как для эндобиоптатов. Есть доступ реагентов почти к каждой клетке. Поэтому смачивание водой поверхности блока при микротомии дает немного жидкости сухой крови, через 30-60 сек она проникает в кровь и срез получается хороший.
Чтобы сэкономить время фиксации есть две возможности: вырезать изначально куски толщиной не более 1 см (это технически просто) или хотя бы разрезать почку вдоль, оставить в формалине до утра. Утром вырезать куски нужной толщины (3 мм) и оставить до утра в свежей порции 10% нейтрального забуференного формалина. На следующий день начаь проводить и т.д.
Вторая возможность более совершенная, но труднее технически: перфузия фиксатора в целый орган через входящую артерию (для этого нужен специальный навык). Зато через сутки можно с полной уверенностью гарантировать, что любая часть органа будет сохранена как положено. Тем не менее, после такой фиксации и вырезки кусочка 3 мм я еще бы оставил вырезанные кусочки на сутки в формалине ит.д.
|
| |
| |
| Pesikot | Дата: Суббота, 2012-02-11, 4:53 PM | Сообщение # 294 |
|
Рядовой
Группа: Проверенные
Сообщений: 6
Статус: Offline
| Спасибо, Maxim! К сожалению, у меня не получается выложить фото блока. Но выяснился один мой косяк при заливке, попробую его исправить и тогда посмотрю, может в нем все дело.
|
| |
| |
| Anykey | Дата: Четверг, 2012-02-16, 1:19 PM | Сообщение # 295 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 1
Статус: Offline
| здравствуйте, подскажите пожалуйста. после фиксации в буферном формалине аутопсийного материала промывка так же проводится в проточной воде (для дальнейший молекулярных исследований)?методика проводки после промывки такая:
1. 80% спирт, 1 час
2. 80% спирт, 1 час
3. 96% спирт, 1 час
4. 96% спирт, 1 час
5. 100% спирт, 1 час
6. 100% спирт, 1 час
7. 100% спирт, 1 час
8. 100% спирт, 1 час
9. толуол, 1 час 10 минут
10. толуол, 1 час 10 минут
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2012-02-16, 9:14 PM | Сообщение # 296 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Anykey!
Забуференный формалин не очень хороший фиксатор для молекулярных исселдований.
Если есть возможность, лучше воспользуйтесь хотя бы Карнуа, а лучше модифицированным метакарнуа.
Это 8 частей по объему метанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты.
Если нет ни метанола ни хлороформа, то воспользуйтесь 96% этанолом (это совсем по бедности). Все ж лучше, чем формалин.
В протоколе проводки дублирующие позиции 80%, 96% и 100% этанола излишни.
Проще:
80% спирт 1 час
96% спирт 1 час
100% спирт 1 час х 3 смены
толуол 3 х 1 час
Встречный вопрос: каким образом удается достичь концентрации спирта 100% или это не этанол?
|
| |
| |
| Татьянка | Дата: Вторник, 2012-03-06, 10:19 PM | Сообщение # 297 |
 Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 1
Статус: Offline
| Здраствуйте!!!Прошу дать ответ на такой вопрос - Сколько дней даётся на ручную проводку гисто-анализа,эндоскопия,эрозия и операционный материал(матка)???И как считается с выходными днями или только рабочие дни?А есть какие нибудь на эти работы расценки?И какая дневная норма анализов на одного лаборанта
,если есть приказ напишите?
Сообщение отредактировал Татьянка - Вторник, 2012-03-06, 10:30 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2012-03-08, 1:18 PM | Сообщение # 298 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Татьянка!
В силу того, что не существует стандартизированого или какого-то единого метода проводки, равно как и изобилие реактивов для проводки, и как следствие многообразие расписаний проводки равно самому количеству лабораторий (или даже по 2-3 расписания в каждой лаборатории), то и время проводки ВСЕГДА варьирует и не узаконено никаким приказом.
Мелкие биопсии проводятся в разы быстрее, чем обычный операционный материал и аутопсии.
Чаще других встречаются протоколы для проводки эндоскопийного материала от 1.5 часов в автомате до 4 часов вручную, и для операционного материала от 3 часов (специальные протоколы в гибридных микроволновых процессорах), 8-9 часов ночная проводка в вакуумных и карусельных процессорах до 16-40 часов вручную.
Ручной метод помимо общих недостатков (отсутсвие механического перемешивания, вакуума, давления, подогрева) имеет необходимость задержки в промежуточной среде на ночь, и следовательно любая ручная проводка болшого количества материала будет занимать не менее 2 рабочих дней.
Второе - неободимость учета времени на задачи до проводки (вырезка и подготовка к проводке), фиксация (не менее 24 часов в 10% нейтральном забуференном формалине) и время всех задач после проводки (заливка, микротомия, подготовка и окраска стекол). Общий поток раоты в гистологической лаборатории идет в среднем со скорость 4 блока в час. При автоматизации окраски и заключения под стекло скорость возрастает до 7 блоков/час.
Время проводки может составлять от 3 до 34% рабочего времени, оно зависит от технологии, но от проводки не зависит время выполнения всех других этапов. Задачи после проводки требуют столько времени, сколько задачи до проводки и сама проводка. Время фиксации здесь не учитывается!
Детали по расчетам времени для лабораторий с разным объемом вы можете найти в статьях о продуктивности, размещенных на главной странице этого сайта. В статье "Уровни для штата" описаны расчеты нагрузок для любого персоанала лабораторий.
|
| |
| |
| ksentippa | Дата: Воскресенье, 2012-04-01, 1:54 AM | Сообщение # 299 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Статус: Offline
| Здравствуйте! Извините новичка за глупый вопрос. Подскажите, пожалуйста, как правильно проводить глаз крысы? Поиски в интернете и библиотеке не очень помогли. Вопросы возникают уже на стадии забора материала, но тут ладно, как-нибудь приспособимся очень аккуратно энуклеировать. Мне нужно рассмотреть задний сегмент, то есть хрусталик мне не нужен. В одних статьях фиксируют глаз целиком, некоторые в проводку берут только задний сегмент, некоторые часов 6 целиком, потом обрезат, удаляют хрусталик и переднюю часть и ещё 24 часа фиксируют. Резать целиком с хрусталиком у меня не получилось (жуть). Изначально обрезанный задний сегмент в проводке расслоился, пока пробую что-то среднее - фиксирую целиком, а перед промыванием обрезаю нужное. А как это правильно делается:-)? В старых учебниках рекомендуют Буэна, сейчас в статьях пишут, что фиксируют в основном 4% ПФГ, иногда ПФГ+глутаральдегид. ПФГ мне ближе - он у меня есть:-) И глутаральдегид тоже, он нужен? Зачем? Фиксировать 24 часа - правильно понимаю?, хоть глаза и небольшие. Нужно водой промывать, сколько? Потому что в каком-то руководстве писали, что именно глаза лучше сразу в 70*спирт сунуть - так сетчатка не отслаивается, но руководство древнее. А сетчатка у меня конкретно отслоилась... Изопропанола под рукой нет, и лаборатория очень консервативная, так что играюсь со спирт-ксилольной проводкой. И тут тоже ряд вопросов... Например мозги мы проводим через этанол(батарея)-бутанол(ночь)-ксилол (до просветления, около часа суммарно)-парафины. Зачем нам бутанол - не знаю, это традиция, такой модификации проводки мне не встретилось нигде. Но замечательно работает... на кусочках мозга. Но скрючивающиеся глаза (и эта отслаивающаяся сетчатка) явно требую чего-то более бережного, чем несколько смен разных реагентов без промежуточных (смешанных) стадий. Сейчас у меня получается такая система 4%ПФГ (24 ч)-вода (1 ч) - 50*70*80*96*96*(по часу)-ночь в бутаноле(?) или 96*спирте - ксилолы (минут 10-20, быстро просветляются)-парафины . Пробовала с промежуточной стадией ксилол+парафин (каша) в термостате - это нужно? Маститая сотрудница уверяет меня что такие тонкие субстанции (как кусочки глаза) в ксилоле надо держать ещё меньше чем 10 мин, что это из-за ксилола срезы крошатся и ткань "обожжена"... Я уже запуталась окончательно)) Очень прошу работающую методику проводки крысиных глаз! Заранее огромное спасибо!
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2012-04-02, 7:25 AM | Сообщение # 300 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| ksentippa!
Струткуры глаза (кроме стекловидного тела, которое вытекает при вырезке) практически не содержат воды и жира. Поэтому длительное обезвоживание здесь не нужно. Достаточно будет 4-5 этанолов по 30 мин (или меньше), затем этанол:ксилол 1:1 20 мин, 2 ксилола по 20 мин (или по 15), ксилол:парафин 1:1 30 мин при 40оС, 3 парафина по 30 мин. Промежуточные смеси спирт:ксилол и ксилол:парафин смягчают переходы между этими веществами. Сетчатка глаза действительно очень сложный объект. Эта же проводка должна подойти для всех крысиных тканей. Лучше, конечно избавиться от этанола и ксилола для этих целей. Бутанол слишком отвратительно пахнет, но действует подобно изопропанолу. Я не вижу особого смысла тратиться на бутанол, если ИПА везде доступен и принят в работе многих лабораторий.
За рабочий день провести глаза успеете. Резку лучше отложить на следующий день. При резке не забывайте смачивать блок водой, срезы будут получаться лучше.
Фиксация целого глаза 24 часа в 10% нейтральном забуференном формалине, затем вырезка центрального сегмента и снова 24 часа в свежей порции формалина. Промывка в медленно текущей воде 20-30 мин для удаления избытка фосфатов.
Можно срезы дофиксировать Буэном. 1 час при комнтной температуре после удаления из них парафина. Далее промывка в воде для удаления пикриновой кислоты и т.д.
|
| |
| |
|
|
