Вы вошли как Гость
Текущая дата: Среда, 2024-04-24, 10:48 PM
|
Проводка и заливка
|
|
| Галина | Дата: Суббота, 2015-11-21, 10:01 PM | Сообщение # 466 |
 Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Статус: Offline
| Maxim, Спасибо за быстрые вразумительные ответы...
|
| |
| |
| oks-gricik | Дата: Четверг, 2015-12-24, 12:00 PM | Сообщение # 467 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Здравствуйте, уважаемый Максим и все участники форума!
Несколькими страницами ранее я отписывалась о своих результатх с проводкой. Органы мышей и крыс. Результаты были не идеальные, но препарвты получались и фотографировать было что. Для выполнения следующего задания я как-то опрометчиво провела полностью весь материал - мозг крыс. Изопропанолы по 20 минут, масло 5:1 и 2:1 по часу. Парафины - первый 30минут, остальные по 20. У меня гистомикс БВ. Режется плохо. При подрезке на большой толщине крошится в опилки, при 5-7мкм смоченные водой частично белеют и как будто режутся неплохо и на стекле ровные. А под микроскопом.... по краям бахрома, внутри трещины. Для фотографии это пригодно плохо, а как провести морфометрию провести я даже не представляю. Причем на этой же проводке этими же руками печень, селезенка, легкие, сердце, желудок - вполне нормально резались и читались.
Максим, подскажите, пожалуйста, на этом (все уже в блоках и архива нет) этапе что-то можно предпринять для улучшения срезов? Сегодня попробовала заморозить и перед резкой подержать на хладагенте - порезалось лучше. Но еще не красила.
С уважением, Оксана.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2015-12-24, 4:40 PM | Сообщение # 468 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая oks-gricik!
Давайте проверим все ключевые моменты.
1) Толщина блока мозга? Если не толще 3 мм - хорошо. Время фиксации 24-48 часов, соотношение фиксатор/ткань 20/1. Формалин 10% нейтральный забуференный.
2) Реагенты для проводки - кто производитель (можете отвечать в ЛС).
3) Расписание проводки можно применять как для обычных человеческих хирургических кусков (5 ИПА х 1 часу, смеси и масло по 1.5 часа каждая, масло можно оставить до утра, 4 парафина по 1 часу). Я недавно также возился с тканями крыс (почки, печень и кости) и это расписание отлично сработало, я работал с десятками кусочков. В ткани мозга очень много жира, поэтому он должен быть вырезан не толсто, и хорошо обработан в ИПА. Пока из кусочка не уйдет весь жир, пропитывание маслом и парафином не начнется.
Сдается мне, что в вашем случае кол-во и время в ИПА, смесях и масле было недостаточным, а пропитывание парафином неэффективно, или кусочек был толще 5 мм.
Что можно сделать с блоками. Наша цель - удалить остатки воды, жира и и спиртов из блока.
Способ первый.
Расплавить парафин на нагревательной плите или в термостате и провести все назад, причем время в масле и смесях увеличить до 2-6 часов. Потом перенести в ИПА чистый, 3 смены по 1.5-2 часа каждая и в последней смене оставить до утра. Утром смеси и масло по 2-3 часа. Уходя домой оставить до утра в масле. Утром 4 парафина по 1 часу. Залить, оставить блок до утра в морозилке и на утро резать.
Почему так? Ткани в этом случае являются частично проведенными и обратное замещение на масло и спирт требует времени и масло тяжелее растворяет парафин. Ведь при прямой проводке мы идем от масле с комнатной температурой в нагретый парафин и диффузия масла в расплавленном парафине проходит легче, чем обратная диффузия застывшего парафина в масло при комнатной температуре. Немного облегчить этот процесс можно, поместив блок из парафина в масло в термостате на 1-2 часа. Уходя домой блок нужно до утра оставить в масле, но при комнатной температуре. Нагрев в любом случае уплотняет ткани и никак не облегчает диффузию в участках, где осталась вода (это как раз те участки, которые тянутся за ножом, белые и мягкие).
Способ второй.
Этот вариант может показаться сумасшедшим, но он тоже работает - проверено много раз во многих лабораториях.
Расплавить блок на нагревательной плитке и промокать горячий блок сухой и чистой фильтровальной бумагой до отхождения основной массы парафина из кусочка. Обычно 15-20 минут достаточно. Изводится много бумаги, но это важно. Затем кусочек поместить в 10% формалин до утра в термостат 40оС можно и 50оС, но не выше. Затем провести по расписанию проводки, которое я написал выше. Остатки жидкости уйдут благодаря обычной диффузии, которая происходит по градиенту концентрации, т.е. из объекта, где жидкости много в спирты, где ее мало. Спирты притягивают воду и удаляют ее из кусочка. Они же удаляют жиры. Далее начинается пропитывание маслом и завершается удаление жиров. Тщательно пропитанные маслом ткани, не содержащие воды и жиров легко и полностью пропитываются парафинами. Далее заливка, и т.д., как описано выше.
Я уверен, что у Вас получится.
Нам всем интересно будет узнать о результатах. Отпишитесь.
|
| |
| |
| oks-gricik | Дата: Четверг, 2015-12-24, 5:32 PM | Сообщение # 469 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Максим! Благодарю за ответ!
Завтра же запущу по несколько кусочков и первым и вторым способом.
Мозг вырезала 2-3мм, половина гиппокампа - и того меньше. Фиксация 10% забуференным формалином БВ около 10 дней.
Изопропиловый спирт вот такой http://178.210.75.222/katalog/khimreaktivy/rastvoriteli/173-propanol-2-izopropilovyj-spirt-2.html
масло И20А. Все реагенты свежие. Обязательно отпишусь о результате. Спасибо большое!
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2015-12-24, 5:52 PM | Сообщение # 470 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая oks-gricik!
Масло И20А и смеси нужно использовать в термостате 50оС, иначе пропитывания не произойдет! Смеси с маслом и масло должны быть полностью прозрачными и не расслаиваться в нагретом виде. Надеюсь, вы это помните.
|
| |
| |
| oks-gricik | Дата: Четверг, 2015-12-24, 5:56 PM | Сообщение # 471 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| да. у меня даже одно время отдельный термометр был для проверки температуры именно в банках со смесями (контролировала термостат)
|
| |
| |
| первопроходец | Дата: Четверг, 2015-12-31, 1:02 AM | Сообщение # 472 |
 Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 51
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги, с наступающим Новым Годом! Здоровья, здоровья и еще раз здоровья!
|
| |
| |
| ksentippa | Дата: Вторник, 2016-01-12, 9:33 PM | Сообщение # 473 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги! С Новым годом! Здоровья, удачи и замечательных срезов:-) Добавлено (2016-01-12, 8:38 PM)
---------------------------------------------
В прошлом году, в сообщении 449 я писала о том, что крысиный мозг хорошо режется старыми большими стальными ножами, но неизменно превращается в лапшу на одноразовых лезвиях, причем это происходит и на доисторическом Райхерте, и на советском древнем, и на новейшей японской Сакуре. Потом длительное время не имела возможности ответить и поблагодарить Максима за предположения, почему так происходит.
Большое Вам спасибо!!!
Цитата недостаточное пропитывание парафином ткани.
Цитата нужно проверить угол наклона лезвия. Лучше всего настраивать угол резки на пустом блоке.
проверить крепко ли затянуты все зажимы
смочить поверхность резки водой
Срезы делать нужно медленно.
Все болты и зажимы затянуты до предела.
Смачивание не помогает.
Скорость не влияет.
Цитата точить нож вручную
пойти в другие лаборатории и посмотреть, как они работают. Если классно режут - предложите порезать им свой блок и посмотрите, как это сделают они. Заодно и выяснится, что делаете не так.
Несколько лабораторий в институте работают на старых ножах и продолжают их точить. Одна лаборатория купила новый микротом и пытается использовать одноразовые лезвия - их результат похож на мой, с мозгом крысы хуже всего, но и с другими тканями не очень-то - горизонтальные разрывы или в лучшем случае сильные горизонтальные следы от ножа, хорошо выглядят только железистые ткани (?). То есть дело в проводке? У них тоже была спирт-ксилольная, как и у нас.Добавлено (2016-01-12, 9:21 PM)
---------------------------------------------
Цитата Maxim (  ) добивайтесь качества проводки, чтобы можно было работать на новом приборе.
1) Появились деньги и я могу, никого не уламывая, перейти на Ваш вариант проводки!
2) На одном мозге попробовали 5 часов Изопропилового спирта (без масла пока, но, главное, без ксилола) и он нормально порезался одноразовым ножом!!! Теперь ещё надо посмотреть, будет ли он пригоден для иммунки, но начало положено:-)
Теперь масса вопросов:-)
Основной (95%) мой объект - мозг крысы, причем мне нужен гиппокамп почти весь, на много стекол для разных антител, то есть вырезать кусочек тоньше 5 мм я не могу, - это большая проблема. Получается где-то 1 см*0,5 см*0,5 см. Ручная проводка. Срезы 7 мкм, роторный микротом, обязательно нужна лента, ИГХ с антителами и ДАБом в конце. Количество очень небольшое.
1) Фиксация в забуфер. ПФГ (Иммунофикс, Биовитрум) - считается мягче формалина и лучше для ИГХ, или лучше формалином на Ваш взгляд?
Ещё пользовались MOLFIX (Италия, Millestone), к нему надо добавлять 2/3 этанола и получается фиксация в 70% спирте, хоть и с каким-то загадочным фиксатором для молекулярных исследований - это меня смущает и стараюсь им не пользоваться, не знаете про такой?
2) Фиксация 1/3 мозга крысы в ПФГ 2 ч при комн. темп., потом подрезание до минимального размера, потом 24 ч в ПФГ в холодильнике - этого достаточно? Или лучше не в холодильнике? - считается, что для иммунки лучше в холоде, на всякий случай. Или лучше двое суток?
3) Какие временные промежутки порекомендуете для крысиных мозгов, уменьшать время в изопропаноле по сравнению с человеческим материалом? Боюсь пересушивания и крошения.
4) Какие изопропанол и масло порекомендуете при наличии хороших финансовых возможностей, кучи поставщиков и малом потоке, то есть качество важнее цены?
5) Парафин использую ГистомиксЕкстра (Биовитрум) и для проводки и для заливки - стоит для заливки использовать какой-то другой?
6) Для депарафинизации стекол используем ксилол (+спирты) - пройдет ли строго для ИГХ депарфинизация в мыльном растворе, как-то смущает меня это почему-то?
6) После депарафинизации (ксилол, спирты) перед антителами мы кипятим наши стекла в пароварке в демаскирующем буфере - при таком кипячении не отваливаются только срезы приклеенные на белок (с которым много возни, сушки), от покупных стекол покрытых адгезивом (полилизином?) много отваливалось, Биовитрумовский адгезив (такая баночка с кисточкой для нанесения - удобно и быстро) рискую использовать только для Г-Э кипятить на ИГХ боюсь. Вы чем приклеевать порекомендуете?Добавлено (2016-01-12, 9:33 PM)
---------------------------------------------
7) Если у меня получится нормальная нарезка и иммунка с изопропанолом-маслом, то возникает вопрос, а нельзя ли как-нибудь уже готовые парафиновые блоки с мозгами, проведенными через спирт-ксилол, провести обратно и переделать на изопропанол? :-) Может тогда они нарежутся?-)) А то буквально пропадает материал от крыс (штук 40 блоков:-((() с которыми возилась полгода:-(
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2016-01-14, 0:22 AM | Сообщение # 474 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Ksentippa! Ответ длинный - но и вопросов много разных и сложных.
Я сначала отвечу на вопросы по цитатам, поскольку они были первые и требуют рассмотрения. А затем мое видение проблемы с мозгом крыс (кстати, сейчас я тоже занимаюсь тканями крыс - почки и кости и все получается на ура).
Цитата Цитата
недостаточное пропитывание парафином ткани.
Вполне возможно, но блок одинаково хорошо режется на любой глубине старым большим ножом и никак нигде не режется одноразовым.
Цитата Цитата
нужно проверить угол наклона лезвия. Лучше всего настраивать угол резки на пустом блоке.
проверить крепко ли затянуты все зажимы
смочить поверхность резки водой
Срезы делать нужно медленно.
Перепробованы все варианты наклона одноразовых лезвий на 3 микротомах. Пустой блок режется идеально. Мозг крошится в лапшу.
Все болты и зажимы затянуты до предела.
Смачивание не помогает.
Скорость не влияет.
Это подтверждение сказаного мной выше - фиксация неадекватная.
Цитата Несколько лабораторий в институте работают на старых ножах и продолжают их точить. Одна лаборатория купила новый микротом и пытается использовать одноразовые лезвия - их результат похож на мой, с мозгом крысы хуже всего, но и с другими тканями не очень-то - горизонтальные разрывы или в лучшем случае сильные горизонтальные следы от ножа, хорошо выглядят только железистые ткани (?). То есть дело в проводке? У них тоже была спирт-ксилольная, как и у нас. Добавлено (2016-01-14, 0:20 AM)
---------------------------------------------
Добавлено (2016-01-13, 11:58 PM)
---------------------------------------------
Цитата
Основной (95%) мой объект - мозг крысы, причем мне нужен гиппокамп почти весь, на много стекол для разных антител, то есть вырезать кусочек тоньше 5 мм я не могу, - это большая проблема. Получается где-то 1 см*0,5 см*0,5 см. Ручная проводка. Срезы 7 мкм, роторный микротом, обязательно нужна лента, ИГХ с антителами и ДАБом в конце. Количество очень небольшое.
ответ:
Давайте рассудим геометрически. Начинаем резать блок аккуратно, грубо срезая по 30-40 мкм. Первый миллиметр или 1000 мкм пусть уйдет на это. Далее переходим на тонкие срезы. Первые 5-6 срезов, пусть 10 по 7 мкм это 0.07 мм. 7 мкм = 0.007 мм. 1 - 0.07 = 0,93 / 0.007 = 132 среза по 7 микрон можно сделать со второго миллиметра. Пусть даже после 30-40 срезов блок согреется, если будете быстро резать. Итак, если блок был толщиной 3 мм в запасе останется по сотне срезов. Неужели не хватит?
Что касатесся толщины для ИГХ, то здесь было бы хорошо иметь срезы не толще 4 мкм. Тогда вероятность отпадания от стекол гораздо меньше.
Вырезать блок толщиной 3 мм очень просто - возьмите использованное одноразовое лезвие.
Толщина 3 мм допускает время фиксации минимум 24 часа, но в экспериментальных случаях лучше 48 часов (крысам скорость не нужна). Вырезанный кусочек будет свободно лежать в кассете (никаких заворачиваний в марлю!) и реактивы будут легко проникать в кассету и кусочек. Кусочки, придавленные стенками кассеты плохо впитывают реагенты!
Площадь кусочка может быть меньше площади кассеты на мм 2-3 с каждой стороны. Идеально, если кассеты имеют прорезви по боковым стенкам -
есть и такие (turbo flow).
Игнорирование вырезки толщины 3 мм потянет за собой такое:- увеличение времени фиксации до 72 и более часов, причемчем дальше от края, тем картинка фиксации будет неадекватнее, и проблемнее проводка.
- увеличение времени проводки в 3-4 раза, но и это не будет гарантией качества. (совсем недавно проверял - выезал доктор молочку по 6 мм и ни в какую тоньше. Фиксировал 4 дня, проводил еще 5 дней. Срезы получились, но на ИГХ частично облезли. При этом серия правильно вырезанных и проведенных молочек дала отличные срезы и классную картинку на ИГХ. Возложил ответственность на вырезавшего доктора).
- отсутствие гарантии хорошего пропитывания парафином. Плюс длительное воздействие горячего парафина коагулирует белки, сбивая верный результат ИГХ, а также уплотняет ткани.
Цитата
1) Фиксация в забуфер. ПФГ (Иммунофикс, Биовитрум) - считается мягче формалина и лучше для ИГХ, или лучше формалином на Ваш взгляд?
Ещё пользовались MOLFIX (Италия, Millestone), к нему надо добавлять 2/3 этанола
и получается фиксация в 70% спирте, хоть и с каким-то загадочным фиксатором для
молекулярных исследований - это меня смущает и стараюсь им не пользоваться, не
знаете про такой?
2) Фиксация 1/3 мозга крысы в ПФГ 2 ч при комн. темп., потом подрезание до минимального
размера, потом 24 ч в ПФГ в холодильнике - этого достаточно? Или лучше не в
холодильнике? - считается, что для иммунки лучше в холоде, на всякий случай.
Или лучше двое суток?ПФГ - параформальдегид. О том, что это такоехорошо написано здесь:
The Histochemical Journal 34: 365-367,2002 (свободный доступ). Прежде, чем использовать любой фиксатор для ИГХ сначала посмотрите в аннотации к антителам и тест-ситемам, допустимы ли такие фиксаторы. Если нужно, на эл почту могу прислать статьи о формалине и фиксации в ИГХ. Там написано про очень многие фиксаторы и все, что связано с фиксацией.
Я бы предпочел для любых ИГХ-исследований обычный 10%нейтральный забуференный формалин. но производитель должне быть проверенный и надежный.
3 мм кусочки, 24-48 часов, комнатная темпеартура, 20/1соотношение фиксатор/ткань,
после - обязательная промывка 30 минут в проточной воде.
Добавлено (2016-01-14, 0:01 AM) Добавлено (2016-01-14, 0:20 AM)
---------------------------------------------
---------------------------------------------
Цитата
3) Какие временные промежуткипорекомендуете для крысиных мозгов, уменьшать время в изопропаноле по сравнению с человеческим материалом? Боюсь пересушивания и крошения.
ответ:
Ничего уменьшать не нужно, толщина вырезки 3 мм. И все будет ок.
Проводка через изопропанол-минеральное масло. Расписание какдля обычных хирургических кусочков (5 ИПА х 1 час, по 1.5 часа смеси и масло и 4 х 1 час парафин).
По правилам форума не могу называть поставщиков. Хорошо фиксированные и проведенные ткани приклеивать нужнона полилизиновые стекла, SuperFrost, положительно заряженные (любые другие адгезивы не годятся). Толщина 4 мкм. Сушить вертикально. До утра на столе. Перед депарафинированием 60оС термостат 30-40 минут. Срезы без морщин, складок,
пузырей и разрывов.
Депарафинировать можно любым способом. Дополнительное депарафинирование также происходит в демаскировочных буферах, содержащих соли, мыло, и высокую температуру (так делают реактивы производители).
Цитата
7) Если у меня получитсянормальная нарезка и иммунка с изопропанолом-маслом, то возникает вопрос, а нельзя ли как-нибудь уже готовые парафиновые блоки с мозгами, проведенными через спирт-ксилол, провести обратно и переделать на изопропанол? :-) Можеттогда они нарежутся?-)) А то буквально пропадает материал от крыс (штук 40
блоков:-((() с которыми возилась полгода:-(
ответ:
Перепроводка имеющихся блоков дело неблагодарное. Обязательно возникнет куча проблем.
Если не помогает перезаливка в тугоплавкий парафин и хороший микротом с одноразовым лезвием, то нужно делать весь цикл перепроводки (возня очень длительная, муторная - не у каждого хватает нервов, сил и реагентов довести до ума испорченный материал). И не факт, что потом не вылезет фоновая окраска или прочие "гадости" аналитического этапа ИГХ. Ведь успех в ИГХ зависит на 95% от первичной отличной фиксации.
И, конечно, теперь нам интересно будет знать о результате. Пишите. Добавлено (2016-01-14, 0:22 AM)
---------------------------------------------
Чуть выше сообщение 468 о способах перепроводки.
|
| |
| |
| dzubenko-lisa | Дата: Воскресенье, 2016-05-22, 7:31 PM | Сообщение # 475 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 12
Статус: Offline
| Здравствуйте, помогите пожалуйста, веду дебаты с отделом закупок для нашей лаборатории урезают бюджет,нужна информация какими фирмами пользуетесь изопропанола,парафин и лезвия. Пожалуйста помогите. Здесь наверное нельзя фирмы озвучивать, тогда напишите в личку, очень благодарна буду.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Воскресенье, 2016-05-22, 9:27 PM | Сообщение # 476 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Лиза, война с отделом закупок очень трудное дело. Здесь нельзя действовать в одиночку. Прессовать их нужно вместе с зав ПАО (или как там у вас), и максимумом заинтересованных и весомых сотрудников, мнение которых не оспаривается.
Обязательно нужно им (закупкам) дать понять, насколько может хватить выделенных ими средств, а затем- остановка лаборатории. Об этом должны знать не только закупки, но и зав гистологической лабораторией, начмед, главный врач. Они обожают потом уходить в сторону: нас же никто не поставил в известность...
Бывает даже так, что необходимо ставить в известность и горздрав и даже министерство местное. Но они помогают, если являются сочувствующими патолого-анатомической службе.
Закупкам же нужно дать понять, что принятие решение остается за ПАО и никто из них не вправе делать никаких самостоятельных шагов. В противном случае вы останетесь ни с чем. И вас же потом обвинят во всех бедах. Не допускайте этого.
|
| |
| |
| leonora92 | Дата: Вторник, 2016-05-24, 10:35 AM | Сообщение # 477 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 1
Статус: Offline
| Здравствуйте!!! Подскажите пожалуйста можно ли делать проводку не через IsoPrep, а через чистый изопропиловый спирт? Заранее спасибо)))
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2016-05-24, 11:14 AM | Сообщение # 478 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Думаю, да, можно. Но я бы сначала провел параллельные тесты, не вызывающие сомнения в достоверности результатов.
|
| |
| |
| bylavka92 | Дата: Понедельник, 2016-05-30, 5:27 AM | Сообщение # 479 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Здравствуйте! Подскажите можно ли в изопрепе оставлять образцы на ночь? Просто схема проводки по которой мне предложили работать слегка не подходит по времени (тут либо с собой образцы таскать, либо на работе ночевать).... Вот такая схема проводки через изопреп:
1-1час;
2-2 часа;
3-3 часа;
4-4 часа;
5-5 часов;
6-5 часов;
7-5 часов;
8-5 часов.
Парафины:
1-1,5часа;
2-1 час;
3- 1час
Сообщение отредактировал bylavka92 - Понедельник, 2016-05-30, 5:39 AM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2016-05-30, 5:25 PM | Сообщение # 480 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Если нет других возможностей построить расписание проводки, то на ночь можно оставлять в изопрепе. Если образцы правильно фиксированы, то с ними ничего худого произойти не должно. Но лучше расписание сделать так, чтобы не было никаких длительных задержек материала ни в каком реактиве, особенно в горячем парафине. В этой теме на предыдущих страницах мы обсудили очень много всяких вариантов, особенно для ручной проводки.
Трудность метода изопреп-парафин состоит не столько в дегидратации, сколько в адекватном пропитывании парафином. Изопропанол не должен остаться в кусочке на момент заливки. Тогда все будет сделано верно.
|
| |
| |
|
|
