Вы вошли как Гость
Текущая дата: Среда, 2024-04-17, 2:53 AM
|
Проводка и заливка
|
|
| Maxim | Дата: Суббота, 2014-12-20, 5:51 AM | Сообщение # 436 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Георгий, смачивание блока действительно "спасательный круг" при резке избыточно обезвоженных тканей. Но вода проникает в парафин лишь на несколько микрон. Позже ткани начинают набухать и срез перестает получаться. В вашем случае ткань содержит мало воды. И это совсем не значит, что ткань с малым содержанием воды будет легко пропитываться парафином. У дегидратанта есть еще функция обезжиривания, и этап дегидратации для этого есть смысл увеличить. Также пропитывание парафином нужно увеличить, чтобы получить хорошие тонкие срезы. Ткань не пропитается парафином хорошо, если из нее не удален жир. Поэтому у Anatomists и получается проводка. Получится и у Вас.
Ваши ткани с готовностью белеют, так как насыщаются водой, но получается, что они плохо прпопитаны парафином в глубине, а с поверхностными слоями вроде как все благополучно. С поверхности еще что-то удается срезать, смочить водой, и вроде бы все ок, но в этот момент парафин уже начинает нагреваться и сжимается в гармошку. Глубже ткани уже хуже пропитаны. Гистомикс раньше имел точку плавления 54оС, парапласт сигма 56. Поэтому в свое время я от них и отказался. Ведь в лаборатории летом температура воздуха у нас доходит до 35оС. Только и успеваешь грубо подрезать блок, а потом парафин греется. Блоки, лежашие на на стеллаже на уровне роста человека при этом начинают "течь" и сливаются в единый конгломерат.
|
| |
| |
| первопроходец | Дата: Понедельник, 2014-12-22, 11:12 PM | Сообщение # 437 |
 Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 51
Статус: Offline
| Нагревание блоков, особенно летом это действительно проблема, но мы облегчаем свою жизнь очень простым способом: к каждой морозилке в комплекте идут холодильные элементы (отдельно они тоже продаются). Садясь резать кладем замороженный элемент на стол, а блоки (пару штук, чтоб не бегать к морозилке за каждым) "лицом" на него. Размораживается он часа за 1,5-2. Мы их себе накупили сами, меняем при резке и работа летом перестала быть кошмаром 
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2014-12-23, 6:39 AM | Сообщение # 438 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Да, так выходят многие лаборатории из положения. И мы тоже. Но я достаю за одни раз не более 5 блоков, тогда еще можно их порезать по 3 мкм. При резке на 5-7 мкм (харьковскими МС2) можно положить и 20. Это выход для тех, у кого совсем нет средств (кстати, нам приходят эти халдоагенты, вместе с реактивами ИГХ, поэтому мы даже не покупаем их).
Самый нормальный вариант - замораживающая плата на стол от заливочного центра. Но это удвольствие порядка 200-300тр. Даже если прийдется поставить один охлаждающий блок на 4 рабочих места (переставить столы), перестановка того стоит. Я был в лабораториях, где такое счастье есть.
Я уже думал как можно более простыми способами охладить блоки на столе. Варианты с охлаждающией подставкой для ноутбука - ерунда. Позже разобрал кулер для воды, там есть элемент Пельтье - тоже эффект для целей охлаждения блоков на столе никакой. Пробовал и сухой лед смешивать с изопропанолом. Эффект есть, но сухого льда не напасешься. Жидкий азот и изопентан - слишкоммощное заомраживание, нам такое не нужно. Да и алюминиевый баллон с жидким азотом рядом с рабочим местом ничего хорошего не сулит.
Ничего друого кроме хладоагентов эффективнее и доступнее пока не нашел. Может у кого еще есть идеи?
|
| |
| |
| первопроходец | Дата: Пятница, 2015-01-02, 3:25 PM | Сообщение # 439 |
|
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 51
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги!!! С наступившим Вас 2015 годом!!! Здоровья, удачи, любви, достатка и побольше радостных дней!!!
|
| |
| |
| Bacchus | Дата: Пятница, 2015-03-13, 11:56 AM | Сообщение # 440 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Статус: Offline
| Уважаемый Maxim! Прошу дать совет по вопросу фиксации. Из просторов интернета есть информация о высоком качестве ИГХ окраски маммологических образцов (конкретно Her-2) после фиксации тканей цинковым фиксативом, без формалина. Подскажите, пожалуйста, приходилось ли работать с такой фиксацией? Какие результаты? Можно ли рекомендовать такой метод фиксации или лучше выбирать протокол с формалином? Заранее благодарен!
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2015-03-14, 12:36 PM | Сообщение # 441 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Bacchus,
В спецификациях к первичным антителам, а также рекомендациях ведущих российских и иностранных организаций, занимающихся фармакодиагностикой рака молочной железы нет ссылок на иные фиксаторы, кроме 10% нейтрального забуференного формалина, так как внешний домен Her2-рецептора достаточно чувствителен как к фиксации, так и к температуре. На протяжении последних 20-25 лет было предпринято досаточно много усилий, чтобы стандартизировать диагностику Her2-статуса рецепторов в раках молочной железы во многих развитых странах всего мира. Врядли на фоне таких титанических усилий одиночные попытки поставить цинк-формалин на одну планку с 10% нейтральным забуференным формалином будут успешными. Здесь много всяких но. Например:
- экономические соображения (10% формалин всегда дешевле цинк-формалина)
- нет достаточных подтвержденных исследований о сохранности других антигенов в цинк-формалине.
Мое личное мнение: картинка фиксации в цинк-формалине по красоте и качеству не превосходит обычный 10% нейтральный забуференный формалин в обзорной окраске. До фиксации цинк-формалином материала для ИГХ я не добирался.
Обычно к цинк-формалину начинают обращаться те, кто по тем или иным причинам не смог добиться устраивающей его по качеству картинки с 10% нейтральным забуференным формалином, то есть поленился следовать довольно простым правилам фиксации. И я абсолютно уверен, что если бы хоть один из ведущих экспертов по her2-диагностике увидел бы преимущества цинк-формалин для фиксации этого рецептора, то он моментально бы смог убедить и остальных экспертов в этом, а они все потом разработали бы для всех обязательные рекомендации по этому вопросу. Но пока о таких еще не слышал.
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Воскресенье, 2015-03-15, 8:49 PM | Сообщение # 442 |
 ___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Коллеги, во всем мире используют ASCO/CAP рекоммендации. Фиксация проводится в 10% нейтральным забуференным формалине. Основное внимание уделяется времени холодовой ишемии и времени фиксации.
Wolff, Antonio C., M. Elizabeth H. Hammond, David G. Hicks, Mitch Dowsett, Lisa M. McShane, Kimberly H. Allison, Donald C. Allred et al. "Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Clinical Practice Guideline Update." JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY (2013): 3997.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Воскресенье, 2015-03-15, 9:32 PM | Сообщение # 443 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Абсолютно согласен с Patologoanatom. Преаналитический этап еще никому на 100% победить не удалось. Этому вопросу посвящено много исследований. Последние суммированы в этой свежей книге: PreAnalytics of Pathological Specimens in Oncology.
Ее можно свободно скачать на многих сайтах. Единственный недостаток - английский язык.
|
| |
| |
| Bacchus | Дата: Понедельник, 2015-03-16, 4:04 AM | Сообщение # 444 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Статус: Offline
| Благодарю за скорую реакцию. С одним "но": меня интересовал именно цинковый фиксат без формалина. Статья где прочел о преимуществах этого метода (если кому интересно) "Zink-Based Fixative Improves Preservation of Genomic DNA and Proteins In Histoprocessing of Human Tissues" by K.Wester et al., журнал Laboratory Investigation, Vol 83, #6, p.889. 2003. Соглашусь что есть вероятность снижения или отсутствия реакции фабричных антител в отсутствие нейтрального формалина по причине различия химических связей. Но на мой взгляд метод как минимум дешевле и результаты приведенные в статье в отношении Her2 достаточно интересны.
В любом случае - спасибо за отклик!
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2015-03-16, 12:28 PM | Сообщение # 445 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Посмотрел статью. Честно говоря, мало что понял. Все намешали в кучу. Никакой системы в отношении Her2. По одному куску тканей из разных органов, большая часть из них - нормальные. Авторы задались целью показать, что формалин не сохраняет РНК. Это было известно и раньше. Тем не менее, в 10% нейтральном забуференном формалине удается сохранять фрагменты длиной чуть более 300 пар нуклеотидов. Этого бывает часто достаточно для многих молекулярных диагностических целей.
Что касается самого фиксатора. Цинк сам по себе для фиксации не описан. Есть фиксаторы с его добавкой к спирту и уксусной кислоте, есть к формалину. А насчет экономики, возьмите и посчитатйе, что сколько стоит. Да еще попробуйте в аукционах найти поставщика, имеющего РУ Росздравндазора на хористый цинк. А потом, когда выдержите нормально проверку наркоконтроля на правильность учета такого прекурсора, как уксусная кислота, и еще обоснуете его как важный диагностический реагент в госзакупках, только тогда можно будет начать слабенькое, на нескольких сотнях блоках, исследование по сравнению этого фиксатора (при этом еще прийдется обзавестись информированным согласием каждого пациента на участие в этом эксперименте), вот только после слепого сравнения сотен пар стекол да и не одним патологом можно будет обсудить результаты.
Это до 50х годов ХХ века было модно экспериментировать, открывать фиксаторы, что-то сравнивать и никто не мешал. Сейчас каждый шаг в сторону очень сложен как юридически, так и экономически.
Если хотите узнать современное значение формалина, познакомьтесь с этой статьей: Histology without formalin. R.J. Buesa, Annals of Diagnostic pathology, Vol.12, 2008, 387-396.
http://www.histosearch.com/ADP5Formalin.pdf
Там не только про формалин есть, но и про его заменители и про молекулярные фиксаторы и т.п.
|
| |
| |
| Татьяна1793 | Дата: Вторник, 2015-03-31, 0:14 AM | Сообщение # 446 |
|
Рядовой
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Уважаемый, Maxim, здравствуйте! Подскажите, пожалуйста, как Вы утилизируете отработанные орто-ксилол и формалин? Добавлено (2015-03-31, 0:14 AM)
---------------------------------------------
Maxim, здравствуйте! Будьте добры, поделитесь соображениями о целесообразности проводки в микроволновом процессоре для гистологической обработки тканей.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2015-03-31, 11:27 AM | Сообщение # 447 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| По утилизации формалина и ксилола специальных регламентирующих документов нет. Во всяком случае, мне так сообщил человек, прошедший специальное обучение по утилизации в нашем бюро.
Формалин после фиксации мы сливаем в обычную канализацию во время промывки водой препаратов перед дальнейшей проводкой. Таким образом, он растворяется в объеме 20-30 кратно большем объеме воды. Вряд ли в такой концентрации он представляет собой опасность в сточных водах.
Ксилол мы никогда не выливаем в канализацию, также как и все другие неполярные реагенты. Мы их сливаем в канистру и обычно сжигаем в костре (благо, такая возможность имеется).
Нам обещали заключить договор со спецавтохозяйством для утилизации таких вещей, но вопрос так и висит в воздухе уже много лет.
Недалек тот день, когда вместе с закупкой реагентов мы будем приплюсовывать суммы на их утилизацию, чтобы учесть все расходы. Но пока все по-старинке.
Еще мне кажется перспективным приобретение инсенераторов (печей для сжигания), но это нужно объединяться нескольким учреждениям, чтобы этот аппарат себя оправдывал.
По микроволновой проводке.
Микроволны полезны на этапах дегидратации и отчасти просветления. Для пропитывания парафином и смесями с ним они бесполезны. Здесь используется обычный нагрев. Перемешивание и вакуум ускоряют дело. Фиксация с микроволнами до сих пор находится в стадии изучения. Процессор на основе микроволн годится не для всех видов проводки и реактивов. Кроме того, важен принцип построения всего потока работы. Нет смысла ускоряться с проводкой в течение дня, если до вечера не будет все порезано и покрашено и отвечено. Если поток работы полностью автоматизирован и для этого есть людские и реагентные ресурсы - другое дело. Дальше нужно смотреть, чтобы используемая технология позволяла проводить и другие методы исследования, например, ИГХ, молекулярные и генетические исследования, клональность и т.п.
Обычно все эти вещи могут позволить себе лишь единичные, отлично финансируемые учреждения с приличным потоком работы.
|
| |
| |
| Татьяна1793 | Дата: Вторник, 2015-03-31, 11:55 AM | Сообщение # 448 |
|
Рядовой
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Maxim, огромнейшее спасибо за подробный ответ. Что касается сжигания о-ксилола - этот вариант меня больше всего устраивает, с формалином поступаем также как Вы. Надобность в микроволновом процессоре отпала после Ваших разъяснений. )))
|
| |
| |
| ksentippa | Дата: Среда, 2015-04-15, 3:56 PM | Сообщение # 449 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Статус: Offline
| Здравствуйте, уважаемые коллеги! Столкнулась с проблемой при нарезке парафиновых блоков мозга крысы на роторном микротоме с одноразовыми лезвиями: на старых стальных больших ножах получаются идеальные 7 мк срезы, с ножа сходит лента, всё прекрасно, кроме убитости старых ножей и невозможности их нормально точить. Попытка применения к старому микротому Райкерт адаптера для одноразовых лезвий и этих самых лезвий с треском провалилась, на выходе вместо среза драная лапша, думала, что ошиблась при изготовлении адаптера-держателя. Недавно купили новый роторный микротом Сакура со штатным держателем одноразовых лезвий, а картина на выходе точно такая же жуткая - вместо среза просто горизонтальная лапша параллельная ножу, хорошо режется только пустой парафин вокруг ткани, а в центре просто лохмотья. На поверхности оставшегося блока, если посмотреть под углом, видны горизонтальные полосы от ножа. Эти же самые блоки без нареканий режутся на больших старых ножах. Попробовано несколько видов одноразовых лезвий. включая Feather N35HR, который рекомендовали для твердых образцов. Подскажите, в чём может быть загвоздка? И какие выбрать лезвия, чтобы походили на старые советские и немецкие микротомные ножи?:-)
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Среда, 2015-04-15, 8:02 PM | Сообщение # 450 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Ksentippa,
Не совсем понятно, почему так получается. Первое, что приходит в голову - это недостаточное пропитывание парафином ткани. С поверхности всегда пропитывание чуть лучше, поэтому первые срезы получились хорошо, а глубже пропитывания нет, вот и получается ерунда.
Если после неудачи на ротационнике срезы получаются хорошо на любом другом микротоме, то нужно проверить угол наклона лезвия. Лучше всего настраивать угол резки на пустом блоке.
Также нужно проверить крепко ли затянуты все зажимы и подвижные части в микротоме.
Проверьте надежность крепления лезвия в держателе. Лучшие держатели с закрутками на болтах, хуже - с эксцентриковым механизмом.
Ткань мозга грызунов не настолько трудная в работе, чтобы не срезаться на ротационнике SRM200.
Попробуйте на несколько секунд смочить поверхность резки водой и сразу получать тонкие срезы.
Срезы делать нужно медленно.
Попробуйте перезалить объект в парафни с точкой плавления 60оС и охладить в морозилке перед резкой хотя бы полчаса.
Какой год выпуска вашего микротома (Reichert) и его полное название с цифрами? Я не думаю, что в нем есть фиксатор угла наклона лезвия, отдельный, как в современных микротомах. И отсутствие этого фиксатора не позволяет адекватно пользоваться лезвиями в держателе - угол сбивается при передвижении держателя вбок.
Оптимально будет вложиться в приобретение нового ножа в комплекте с камнями и точить нож вручную, если нет много средств и большого потока работы. Если есть поток и ротационник - добивайтесь качества проводки, чтобы можно было работать на новом приборе. ,Саму проводку мы уже обсуждали не один раз в этом разделе.
Лезвия пригодны почти все - нужно приспособиться.
Еще вариант - пойти в другие лаборатории и посмотреть, как они работают. Если классно режут - предложите порезать им свой блок и посмотрите, как это сделают они. Заодно и выяснится, что делаете не так.
|
| |
| |
|
|
