Декальцинация - Форум
 
Декальцинация - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2016-12-09, 4:25 PM

Страница 1 из 11
Форум » ОПЕРАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ » Методики » Декальцинация (Вопросы декальцинации)
Декальцинация
VladpathologДата: Пятница, 2010-06-11, 4:33 PM | Сообщение # 1
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Коллеги, поделитеь опытом декальцинации. Особо интересует декальцинация трепанобиопсий, с учетом последующего качества препарата - возможностью окраски ГЭ, по Ван-Гизон, Перлсу, Гимзе, серебрение и конечно ИГХ. Собственные проблемные препараты покажу позже (праздники). Многие из проблем описаны в книге B.Bain - но там описаны они как факт, как артефакт, а как исправить - информации нет.
 
MaximДата: Пятница, 2010-06-11, 4:44 PM | Сообщение # 2
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
А что за книга Bain? Где ее можно найти в электронном виде?
 
VladpathologДата: Пятница, 2010-06-11, 4:52 PM | Сообщение # 3
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Barbara J.Bain. Bone Marrow Pathology. Скачать здесь можно. Я бы на ящик кинул, но она здоровая - не лезет (книга очень хорошая - жаль в России такого не пишут. Самое обидное, что есть кому).
 
MaximДата: Пятница, 2010-06-11, 5:37 PM | Сообщение # 4
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Спасибо большое! Книга скачалась.

Общая схема:
Фиксация трепанобиоптатов 10% NBF 24-48 часов при комнатной температуре.
Промывка 3 смены физиологического раствора 3 х 10 мин.
Декальцинация в 14% ЭДТА (динатриевой соли), забуференной NaOH до рН 7.0-7.4 до утра (редко дольше).
Промывка 3 смены физиологического раствора 3 х 10 мин.
Проводка через изопропанол-минеральное масло по обычной схеме для хирургического материала.
Заливка, резка, окраска и все далее как обычно.
Проверено, работает хорошо, включая ГХ и ИГХ.

Методы тестирования конечной точки декальцинации в приложении.
Для ЭДТА оксалатный тест не пригоден.
Для взвешивания трепанов лучше пользоваться аналитическими весами.

 
MaximДата: Вторник, 2010-06-29, 0:45 AM | Сообщение # 5
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Виноват, забыл приложить файл.

Добавлено (2010-06-12, 12:54 PM)
---------------------------------------------
Для общих целей (все хирургические и аутопсиные кости) мы используем смесь водных растворов 4% соляной и 8% муравьиной кислот. Также и костный мозг аутопсийный, поскольку ИГХ на таком материале как правило не выполняется.
Главное - не пропустить конечную точку. Взвешивание - очень простой и удобный тест (см. предыдущий ответ, приложение). Сначала кость теряет в весе до 30-40% веса, поскольку кальций удаляется из образца. Я меняю декальцинатор на свежий каждое утро и каждый вечер. Через 2-3 дня (для образца толщиной не более 3 мм) вес достигает минимума и перестает убывать. В этот момент нельзя оставлять кости в декальцинаторе на ночь или выходные, а протестировать вес примерно часа через 2-3. Как только вес начинает расти (вода начинает замещать удаленный кальций и кость "набухает"), кость нужно удалить из декальцинатора и промыть в воде 15-20 минут, затем поместить в фиксатор или дегидратант. Если этого не сделать, соляная кислота начинает гидролизовать белки и ткань мацерируется. Способность окрашиваться нарушается и восстановить ее нельзя никаким способом.

(Я никак не могу понять, почему гидролиз белков в окружающих мягких тканях наступает не сразу, а лишь после удаления кальция. Может быть, кто-нибудь может пояснить?)

Прерывать процесс декальцинации можно, а иногда и нужно. Для этого промыть в проточной воде 10-15 минут, затем поместить в 10% NBF. Возобновить процессс с промывки в проточной воде 10-15 минут, затем поместить в декальцинатор.
Соотношение декальцинатор:ткань не менее 20:1.

Декальцинатор для трепанобиоптатов. (Пободная пропись рекомендуется в универсальной ссылочной книге Bancroft&Stevens 1990. Другие издания не читал. А также примерно этот рецепт описан в Саркисове 1994г):
14% ЭДТА, забуференная NaOH
ЭДТА (динатриевая соль) 250 г
Дистиллированная вода 1750 мл
Добавить ЭДТА в воду на нагревательной плитке с постоянным помешиванием. Когда вся соль растворится в растворе, раствор должен принять "молочный" вид. Оставить раствор насыщаться при комнатной температуре и определить рН (идеально рН-метром). Раствор будет кислым (рН<7.0), но для достижения нейтральной рН (7.0) добавлять насыщенный раствор натрия гидроксида из пипетки, каждый раз небольшими порциями, помешивая. Обычно вам понадобится около 25 мл NaOH для достижения 7.0, но количество может варьировать. Как только раствор достигнет рН 7.0, он не будет больше молочным, а просветлится (это также признак нейтральной рН7.0). (Рецепт предоставлен Rene J Buesa <rjbuesa@yahoo.com>).
Проверено во многих лабораториях на протяжении десятков лет. Работает хорошо.
Декальцинировать обычные трепаны достаточно до утра в большинстве случаев.

Смысл применения этого раствора - в связывании кальция при нейтральной рН, чтобы предотвраить любую попытку гидролиза белков кислотами. Поэтому преимущества ЭДТА в растворах с кислой рН сводятся к нулю, если кроме ЭДТА других кислот в растворе нет. Если ЭДТА + кислота, то декальцинацию производит только кислота, а зачем ЭДТА - непонятно. При рН>8 наступает быстрый гидролиз большинства белков, хотя кальция также удляется очень быстро.

Добавлено (2010-06-29, 0:45 Am)
---------------------------------------------
Что касается гистохимических окрасок, то обычно они хорошо удаются на декальцинированных тканях, если декальцинация была ззакончена в нужной точке.
Однако, после декальцинации в кислотных декальцинаторах железо из срезов удаляется и Вы не сможете покрасить Perls (железо). После декальцинации в ЭДТА при нейтральном рН железо остается в тканях и окраска получается хорошо.
Гимза получается хорошо после деакльцинации в кислотах и ЭДТА - нужно вовремя остановить процесс декальцинации и хорошо промыть ткани. Серебро также хорошо получается (я пользуюсь методом Gomori, но Gordon&Sweet также хорошо работает).
ШИК, амилоид, Массон тоже просто выполняются.
А в чем суть проблем при гистохимических окрасках трепанов?

Прикрепления: ___.doc(38Kb)
 
Форум » ОПЕРАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ » Методики » Декальцинация (Вопросы декальцинации)
Страница 1 из 11
Поиск: