Красители для гистологии - Форум
 
Красители для гистологии - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Понедельник, 2016-12-05, 7:28 AM

Страница 1 из 512345»
Форум » ОПЕРАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ » Методики » Красители для гистологии (вопросы гистохимических окрасок)
Красители для гистологии
VladpathologДата: Среда, 2010-07-21, 7:40 AM | Сообщение # 1
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Обсуждаем вопросы, связанные с любыми гистохимическими окрасками Браше, Гимза, Суданы и т.п. (преренесено из технических вопросов).
 
MaximДата: Среда, 2010-07-21, 10:28 PM | Сообщение # 2
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемые коллеги!
Поделитесь, пожалуйста, опытом окраски кислотоустойчивых бактерий (Циль-Нильсен, Киньун, Файт, что-нибудь еще).
Вы пользуетесь готовыми наборами (фирма-изготовитель) или самостотятельно готовите красящие и дифференцирующие растворы? Если делаете сами, то по каким прописям (если не жалко)?
Положительное контрольное стекло добавляете в каждую партию стекол?
Как часто находите микроорганизмы при морфологически 100% картинке tbc?
Используете ли какие-нибудь дополнительные окраски для микобактерий, включая ИГХ (антитело, производитель, система)?
Просто интересно, кто и как это делает. Иногда мы получаем отрицательные результаты окраски по Циль-Нильсену при 100% морфолгии и клинике. Я разыскиваю микробы только на иммерсии (никаких 40х) и во всех срезах. Мысли склоняются к тому, что наш Циль-Нильсен где-то врет...
Как Вы входие из подобных ситуаций?
Как часто окрашиваете аутопсийный материал этими окрасками?
 
ЧаконаДата: Пятница, 2010-07-23, 0:50 AM | Сообщение # 3
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 105
Репутация: 5
Статус: Offline
Про Циля.

Эту краску готовлю сам. Но срезы красить потребовалось всего пару раз - у лабораторных животных микобактериозы (Myc. avium intracellulare) редки. В тех случаях, которые я исследовал, микобактерий не нашлось. Окраска страшно не понравилась тем, что портит общую морфологию препарата (неизбежные даже при аккуратной работе трещинки и т.д.).

Но думаю, Максим, что Вы недалеки от истины в своих опасениях насчет врак Циля, и вот почему. Как-то еще школьником во время микробиологических штудий на кафедре местного института я вместе с доцентом покрасил паралелльные серии "мазков-близнецов" (получаются раздаливанием комочков мокроты между двумя стеклами с последующим их разъединением) по Цилю-Нильсену и ауромин-родаминовым методом (требует просмотра в люминесцентном микроскопе). Так вот, среди них было много таких случаев, где мы на Циле находили какую-то одну микобактерию (и то, были не уверены), а в люминесцентном микроскопе поле зрения было буквально усеяно туберкулезными палочками, как небо - звездами. Мокрота была заведомо туберкулезная.

Добавлено (2010-07-23, 0:29 Am)
---------------------------------------------
Кстати сказать, в мазках из культуры туберкулезных микобактерий (в смеси с какими-нибудь стафилококками) окраска у меня тогда отлично получалась.

Добавлено (2010-07-23, 0:37 Am)
---------------------------------------------
Так что, по-моему, это дефект метода. Другой вопрос, в чем его (дефекта) причина...

Добавлено (2010-07-23, 0:50 Am)
---------------------------------------------
Сейчас заглянул в Лилли и с огорчением нашел, что, оказывается, [превосходный] ауроминовый метод негоден для срезов (почему?). Правда, мы окрашивали не совсем так, как в написано в этой книжке - и родамин был в красящей смеси, и зачем-то потом, после дифференцировки, обрабатывали синькой Эванса (деталей не помню - 15 лет прошло).

 
ludvikДата: Пятница, 2010-07-23, 8:39 PM | Сообщение # 4
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 34
Репутация: 0
Статус: Offline
Добрый вечер! Не к гистохимии вопрос. Купили в Биовитруме готовый набор для окраски Конго рот- уже второй. Отличается по технике окрашивания - в новом после реагента А надо сразу капать реагент В. В итоге все в розово-красном фоне,ничем не отмыть. Может , у кого есть действующий протокол . Спасибо
 
MaximДата: Пятница, 2010-07-23, 8:48 PM | Сообщение # 5
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Ниже проколо, который я использую более 10 лет. Никаких сбоев и фокусов.
Ссылка: Bancroft&Stevens 1990.

АМИЛОИД – метод Highman (1946).

ЦЕЛЬ: Демонстрация отложений амилоида в тканях.
КОНТРОЛЬ: Ткани с установленным содержанием амилоида.
ФИКСАЦИЯ: 10% формалин. Не использовать фиксаторы, содержащие пикриновую кислоту.
ТЕХНИКА: Резать парафиновые срезы 10 микрон.
РЕАГЕНТЫ: КОНГО КРАСНЫЙ
Конго красный (C.I. №22120) 0.5 г
Этанол 95% 50 мл
Вода дистиллированная 50 мл.
Внимание: Пожароопасен. Возможный канцероген.

ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЙ РАСТВОР
(0,2% ГИДРОКСИД НАТРИЯ В 80% ЭТАНОЛЕ)
Натрия гидроксид 0,2 г
Дистиллированная вода 16 мл
Этанол 95% 84 мл.
Внимание: Пожароопасен.

ГЕМАТОКСИЛИН LILLIE (см. гематоксилин)

0,25% СОЛЯНАЯ КИСЛОТА
Дистиллированная вода 400 мл
Соляная кислота, концентрированная 1 мл.

ПРОЦЕДУРА:
1. Довести срезы до дистиллированной воды.
2. 1% конго красный 10 минут или дольше.
3. Быстро сполоснуть в дистиллированной воде.
4. Дифференцирующий раствор, 3-20 маканий (5-30 секунд).
5. Проточная вода 5 минут.
6. Гематоксилин Lillie 5 минут.
7. 0,25% соляная кислота, 10-30 маканий.
8. Проточная вода 2 смены по 3 минуты каждая.
9. Обезводить, просветлить, заключить.

РЕЗУЛЬТАТ:
Амилоид, цитоплазма париетальных клеток желудка, кератин, гранулы нейтрофилов красные
Ядра синие.

 
VladpathologДата: Суббота, 2010-07-24, 12:39 PM | Сообщение # 6
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Циль-Нильсен планируем приобрести в Биовитруме готовым набором, хотя недавно пролистывал Dako-вский каталог и наткнулся на антитела в отношении микобактерий туберкуле за - заинтересовался; вспомнил спор, который возник на дружественном сайте "Я патолог", когда не могли прийти к согласию при диф.диагностике б-ни кошачьих царапин и туб.лимфаденита, а такие случаи далеко не редкость. Учитывая достоверность результата при ИГХ исследовании и скорость постановки - нужно обдумать и этот вопрос (тем более вы говорите, что Циль-Нильсен обманывать может).
 
MaximДата: Среда, 2010-07-28, 0:04 AM | Сообщение # 7
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
А чем покрасить хламидии в срезах гистохимически?
Грбы-то видно и по Граму и в серебре.
Кто что делает и как выходит из таких положений?
 
ЧаконаДата: Четверг, 2010-07-29, 1:53 PM | Сообщение # 8
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 105
Репутация: 5
Статус: Offline
Quote (Maxim)
А чем покрасить хламидии в срезах гистохимически?

Попробуйте ШИК. Во всяком случае, существует методика их окраски в мазках раствором Люголя, в основе которой лежит окрашивание гликогеновой оболочки. Еще можно Гимзу, на мазках делается, но чувствительность низкая - процентов 20.
А если уж хочется совсем хорошо, стопроцентно и в срезах - без ИГХ ничего не выйдет. Хотя бы и поликлональными антителами.

Добавлено (2010-07-29, 1:53 PM)
---------------------------------------------

Quote (Maxim)
Поделитесь, пожалуйста, опытом окраски кислотоустойчивых бактерий (Циль-Нильсен, Киньун, Файт, что-нибудь еще).

Quote (Илья Ильич Мечников)
Для окрашивания применялись почти все известные методы; наилучшим из них оказался метод, предложенный доктором Кюне из Висбадена. Этот метод я изучил по первоисточнику и пользуюсь случаем поблагодарить доктора Кюне. Так как автор еще нигде не описал своего метода, то я считаю необходимым (конечно, с разрешения автора) кратко описать его здесь. Применяется комбинированная окраска фуксином, гематоксилином и светлой кислой анилиновой краской - аурамином, благодаря чему туберкулезные ткани окрашиваются в три цвета: клеточная протоплазма - в желтовато-серый, клеточные ядра - в фиолетовый, а туберкулезные бациллы - в красный цвет. Для обесцвечивания кислоты не применяются. Сначала срез помещают в крепкий раствор гематоксилина или в более слабый раствор кампешевого экстракта по Клейну, с квасцами. Избыток краски удаляется промыванием водой, которую удаляют, погружая срез на недолгое время в абсолютный алкоголь. Срезы, окрашенные в фиолетовый цвет, переносят затем часа на два в фуксин, приготовленный следующим образом: насыщенный спиртовый раствор фуксина разбавляется смесью из равных частей однопроцентного раствора углекислого аммония и тимоловой воды. После того, как сильно окрашенные срезы промыты водой и обезвожены алкоголем, их на несколько минут помещают в анилиновое масло, затем в скипидар, и из последнего на несколько минут в ксилол, а через небольшой промежуток времени - в чистое анилиновое масло. После этого их помещают в концентрированный раствор аурамина в анилиновом масле , где они должны оставаться 10-15 минут. Из этого раствора их снова переносят в чистое анилиновое масло, затем в скипидар и ксилол, и, наконец, заключают в ксилоловый раствор дамаровой смолы. Описанный метод можно рекомендовать как лучший не только для исследования туберкулеза, но и для изучения взаимоотношений клеток с другими бактериями ("Фагоцитарная роль гигантских клеток при туберкулезе" (1888) - И.И.Мечников, Вопросы иммунитета (избранные труды), М., 1951, стр. 135-136

smile

 
MaximДата: Четверг, 2010-07-29, 4:40 PM | Сообщение # 9
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Спасибо за цитаты. Интересно, но для сегодняшнего дня слишком мудренно и опасно.

За это время я добыл немного немецкого порошка основного фуксина и сделал новый краситель. Гораздо четче видны бактерии и фон светелее и приятнее. Таким образом, мой краситель советского производства (начало 90-х) никуда не годится. Но в целом проблема остается.

По хламидиям. Я пробовал много раз ШИК и даже как-то находил хлаиидии при окраске ШИК, но очень неуверен: сишком широкий спекрт веществ окрашивается по ШИК. У меня соменение в том, что при исследовании мазков-отпечатков и срезов с хламидиями они без проблем видны в мазках и отвратительно в срезах. Грам (красные), Гимза (синие) и ШИК не дают согласовванного понятия о наличии хламидий. Оставется топтаться возле гранулематозных процессов без указания возбдителя. Пробовал я и метиленовый синий - фуксин в разных вариантах (Павловский, Castaneda, Makkiavelli) - тоже все невнятное. Warthin-Starry красит остатки в макрофагах в черный цвет, но понять ничего нельзя.

 
ЧаконаДата: Четверг, 2010-07-29, 8:16 PM | Сообщение # 10
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 105
Репутация: 5
Статус: Offline
Quote (Maxim)
У меня соменение в том, что при исследовании мазков-отпечатков и срезов с хламидиями они без проблем видны в мазках и отвратительно в срезах. Грам (красные), Гимза (синие) и ШИК не дают согласовванного понятия о наличии хламидий.

А с чего Вы взяли, что на мазках - без проблем? Чувствительность окрашивания по Гимзе я уже назвал - 15-25% от случаев, выявленных иммуногистохимически. Куча артефактов и бессчетные ложнопозитивные результаты. Могу дать ссылку на конкретный (правда, не слишком доступный) источник, где это написано.

 
MaximДата: Четверг, 2010-07-29, 9:47 PM | Сообщение # 11
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Много раз видел и вижу пунктаты гранулематозных лимфаденитов (основная моя специальность - цитолог), где по Гимза ставлю подозрение на хламидии, рекомендую уточнить на ПЦР и практически в 90-95% они подтверждаются. А несколько раз был разный операционный материал (последний - подозрение на рак молочной железы), сделали отпечатки - 100% элеметнарные тельца + ретикулярные тельца, а в срезах ничем никак не смог подтвердить. Кстати ПЦР - хламидии. Вот патологи и постоянно теребят меня: вот тебе случай - ищи хладидии или вообще какой-нибудь инфекционный агент, раскрашивай как хочешь (так как все лаборанты заняты рутиной, обычно гистохимию крашу всегда сам). Вот и н начинаю: ШИК, Грам, Циль-Нильсен, Гимза, Гомори-Грокотт, Вартин-Старри, альциановый синий рН 2.5, метиленовый синий - фуксин. Разумеется, в партии для окраски добавляю положительные контроли. После этого гистохимического набора, если ничего не нахожу - сдаюсь. А хотелось бы иметь положительный результат. может быть, где-то это схема поиска инфекционного агента слаба? В чем? Что еще можно делать в рутине для пользы дела?
За источник буду признателен. Попытаюсь найти.
 
ЧаконаДата: Пятница, 2010-07-30, 8:34 AM | Сообщение # 12
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 105
Репутация: 5
Статус: Offline
Quote (Maxim)
Много раз видел и вижу пунктаты гранулематозных лимфаденитов (основная моя специальность - цитолог), где по Гимза ставлю подозрение на хламидии, рекомендую уточнить на ПЦР и практически в 90-95% они подтверждаются. А несколько раз был разный операционный материал (последний - подозрение на рак молочной железы), сделали отпечатки - 100% элеметнарные тельца + ретикулярные тельца, а в срезах ничем никак не смог подтвердить.

Вы пишете о специфичности, а я - о чувствительности. Разные вещи.

Что до источника - это методичка "Лабораторная диагностика хламидиоза", изданная в 1996г. кафедрой микробиологии Новокузнецкого ГИДУВ"а. Ссылаюсь на нее просто от того, что лежит у меня под рукой. На этой кафедре (а они занимаются также и диагностикой), уже давно оставили Гимзу и всегда для хламидий применяют иммунофлюоресценцию.

 
VladpathologДата: Воскресенье, 2010-08-15, 5:36 AM | Сообщение # 13
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Уважаемые коллеги! В зарубежной литературе повсеместно исользуется PAS реакция или acid Shiff, а на картинках что-то вроде ШИК-реакции. Это одно и то же или нет? И в чем суть этих реакций? Спасибо заранее.
 
MaximДата: Воскресенье, 2010-08-15, 9:14 AM | Сообщение # 14
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Vladpatholog!
Вы совершенно правы, PAS = ШИК.
PAS = periodic acid - Shiff. (перйодная кислота - реактив Шиффа). Часто эту реакцию называют окраской по Хочкиссу, Мак-Манусу, Шабадашу (есть небольшие отличия в этих методах, но суть их остается одинаковой).
В приложении файл, в котором объясняется теория реактива Шиффа и один из методов окраски. В рутинной работе мы вобщем следуем этому протоколу, однако, пользуемся обычным гематоксилином Lillie, требующим последующей дифференцировки в солянокислом спирте (Mayer не требует дифференцировки). Перед ШИК-реакцией эти же срезы красим альциновым синим с рН 2.5 для окраски кислых мукополисахаридов (как Вы догадались, эта рутина для гастробиопсий). Никаких там сульфитных промывок и т.д. Для обычных рутинных целей этод метод вполне достаточный. Иногда патологи запрашивают эти окраски дополнительно вместе или по отдельности.
Важно, чтобы реактив Шиффа хранился в холодильнике и имел светло-жетлый или белый цвет (а не красный или розовый!). Мы капаем его на срезы из пипетки и повторно не используем (хотя это и допускается).
Прикрепления: _-__..doc(90Kb)
 
stasДата: Суббота, 2010-08-28, 7:22 AM | Сообщение # 15
Подполковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 24
Репутация: 3
Статус: Offline
Уважаемые коллеги, разрешите обратиться за советом. Нужна трихромная окраска для исследования нефробиопсий. Хочется в первую очередь четко видеть фибрин. Во всех руководствах микрофото окраски по Массону, однако эта окраска, требует дополнительной фиксации биоптата в фиксаторе Боуэна, что не есть для нас хорошо, так как, вполне возможно, в дальнейшем, материал подвергнется иммуногистохимическому исследованию. Подходит ли для исследования нефробиопсий трихромная окраска по Малори? Или есть другие методы окраски?
Заранее благодарю за помощь.
 
Форум » ОПЕРАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ » Методики » Красители для гистологии (вопросы гистохимических окрасок)
Страница 1 из 512345»
Поиск: