Вы вошли как Гость Текущая дата: Четверг, 2024-03-28, 11:19 PM
Красители для гистологии
|
|
Vladpatholog | Дата: Среда, 2010-07-21, 7:40 AM | Сообщение # 1 |
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Обсуждаем вопросы, связанные с любыми гистохимическими окрасками Браше, Гимза, Суданы и т.п. (преренесено из технических вопросов).
|
|
| |
Maxim | Дата: Среда, 2010-07-21, 10:28 PM | Сообщение # 2 |
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги! Поделитесь, пожалуйста, опытом окраски кислотоустойчивых бактерий (Циль-Нильсен, Киньун, Файт, что-нибудь еще). Вы пользуетесь готовыми наборами (фирма-изготовитель) или самостотятельно готовите красящие и дифференцирующие растворы? Если делаете сами, то по каким прописям (если не жалко)? Положительное контрольное стекло добавляете в каждую партию стекол? Как часто находите микроорганизмы при морфологически 100% картинке tbc? Используете ли какие-нибудь дополнительные окраски для микобактерий, включая ИГХ (антитело, производитель, система)? Просто интересно, кто и как это делает. Иногда мы получаем отрицательные результаты окраски по Циль-Нильсену при 100% морфолгии и клинике. Я разыскиваю микробы только на иммерсии (никаких 40х) и во всех срезах. Мысли склоняются к тому, что наш Циль-Нильсен где-то врет... Как Вы входие из подобных ситуаций? Как часто окрашиваете аутопсийный материал этими окрасками?
|
|
| |
Чакона | Дата: Пятница, 2010-07-23, 0:50 AM | Сообщение # 3 |
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Про Циля. Эту краску готовлю сам. Но срезы красить потребовалось всего пару раз - у лабораторных животных микобактериозы (Myc. avium intracellulare) редки. В тех случаях, которые я исследовал, микобактерий не нашлось. Окраска страшно не понравилась тем, что портит общую морфологию препарата (неизбежные даже при аккуратной работе трещинки и т.д.). Но думаю, Максим, что Вы недалеки от истины в своих опасениях насчет врак Циля, и вот почему. Как-то еще школьником во время микробиологических штудий на кафедре местного института я вместе с доцентом покрасил паралелльные серии "мазков-близнецов" (получаются раздаливанием комочков мокроты между двумя стеклами с последующим их разъединением) по Цилю-Нильсену и ауромин-родаминовым методом (требует просмотра в люминесцентном микроскопе). Так вот, среди них было много таких случаев, где мы на Циле находили какую-то одну микобактерию (и то, были не уверены), а в люминесцентном микроскопе поле зрения было буквально усеяно туберкулезными палочками, как небо - звездами. Мокрота была заведомо туберкулезная. Добавлено (2010-07-23, 0:29 Am) --------------------------------------------- Кстати сказать, в мазках из культуры туберкулезных микобактерий (в смеси с какими-нибудь стафилококками) окраска у меня тогда отлично получалась. Добавлено (2010-07-23, 0:37 Am) --------------------------------------------- Так что, по-моему, это дефект метода. Другой вопрос, в чем его (дефекта) причина... Добавлено (2010-07-23, 0:50 Am) --------------------------------------------- Сейчас заглянул в Лилли и с огорчением нашел, что, оказывается, [превосходный] ауроминовый метод негоден для срезов (почему?). Правда, мы окрашивали не совсем так, как в написано в этой книжке - и родамин был в красящей смеси, и зачем-то потом, после дифференцировки, обрабатывали синькой Эванса (деталей не помню - 15 лет прошло).
|
|
| |
ludvik | Дата: Пятница, 2010-07-23, 8:39 PM | Сообщение # 4 |
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 34
Статус: Offline
| Добрый вечер! Не к гистохимии вопрос. Купили в Биовитруме готовый набор для окраски Конго рот- уже второй. Отличается по технике окрашивания - в новом после реагента А надо сразу капать реагент В. В итоге все в розово-красном фоне,ничем не отмыть. Может , у кого есть действующий протокол . Спасибо
|
|
| |
Maxim | Дата: Пятница, 2010-07-23, 8:48 PM | Сообщение # 5 |
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Ниже проколо, который я использую более 10 лет. Никаких сбоев и фокусов. Ссылка: Bancroft&Stevens 1990. АМИЛОИД – метод Highman (1946). ЦЕЛЬ: Демонстрация отложений амилоида в тканях. КОНТРОЛЬ: Ткани с установленным содержанием амилоида. ФИКСАЦИЯ: 10% формалин. Не использовать фиксаторы, содержащие пикриновую кислоту. ТЕХНИКА: Резать парафиновые срезы 10 микрон. РЕАГЕНТЫ: КОНГО КРАСНЫЙ Конго красный (C.I. №22120) 0.5 г Этанол 95% 50 мл Вода дистиллированная 50 мл. Внимание: Пожароопасен. Возможный канцероген. ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЙ РАСТВОР (0,2% ГИДРОКСИД НАТРИЯ В 80% ЭТАНОЛЕ) Натрия гидроксид 0,2 г Дистиллированная вода 16 мл Этанол 95% 84 мл. Внимание: Пожароопасен. ГЕМАТОКСИЛИН LILLIE (см. гематоксилин) 0,25% СОЛЯНАЯ КИСЛОТА Дистиллированная вода 400 мл Соляная кислота, концентрированная 1 мл. ПРОЦЕДУРА: 1. Довести срезы до дистиллированной воды. 2. 1% конго красный 10 минут или дольше. 3. Быстро сполоснуть в дистиллированной воде. 4. Дифференцирующий раствор, 3-20 маканий (5-30 секунд). 5. Проточная вода 5 минут. 6. Гематоксилин Lillie 5 минут. 7. 0,25% соляная кислота, 10-30 маканий. 8. Проточная вода 2 смены по 3 минуты каждая. 9. Обезводить, просветлить, заключить. РЕЗУЛЬТАТ: Амилоид, цитоплазма париетальных клеток желудка, кератин, гранулы нейтрофилов красные Ядра синие.
|
|
| |
Vladpatholog | Дата: Суббота, 2010-07-24, 12:39 PM | Сообщение # 6 |
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Циль-Нильсен планируем приобрести в Биовитруме готовым набором, хотя недавно пролистывал Dako-вский каталог и наткнулся на антитела в отношении микобактерий туберкуле за - заинтересовался; вспомнил спор, который возник на дружественном сайте "Я патолог", когда не могли прийти к согласию при диф.диагностике б-ни кошачьих царапин и туб.лимфаденита, а такие случаи далеко не редкость. Учитывая достоверность результата при ИГХ исследовании и скорость постановки - нужно обдумать и этот вопрос (тем более вы говорите, что Циль-Нильсен обманывать может).
|
|
| |
Maxim | Дата: Среда, 2010-07-28, 0:04 AM | Сообщение # 7 |
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| А чем покрасить хламидии в срезах гистохимически? Грбы-то видно и по Граму и в серебре. Кто что делает и как выходит из таких положений?
|
|
| |
Чакона | Дата: Четверг, 2010-07-29, 1:53 PM | Сообщение # 8 |
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Maxim) А чем покрасить хламидии в срезах гистохимически? Попробуйте ШИК. Во всяком случае, существует методика их окраски в мазках раствором Люголя, в основе которой лежит окрашивание гликогеновой оболочки. Еще можно Гимзу, на мазках делается, но чувствительность низкая - процентов 20. А если уж хочется совсем хорошо, стопроцентно и в срезах - без ИГХ ничего не выйдет. Хотя бы и поликлональными антителами. Добавлено (2010-07-29, 1:53 PM) ---------------------------------------------
Quote (Maxim) Поделитесь, пожалуйста, опытом окраски кислотоустойчивых бактерий (Циль-Нильсен, Киньун, Файт, что-нибудь еще). Quote (Илья Ильич Мечников) Для окрашивания применялись почти все известные методы; наилучшим из них оказался метод, предложенный доктором Кюне из Висбадена. Этот метод я изучил по первоисточнику и пользуюсь случаем поблагодарить доктора Кюне. Так как автор еще нигде не описал своего метода, то я считаю необходимым (конечно, с разрешения автора) кратко описать его здесь. Применяется комбинированная окраска фуксином, гематоксилином и светлой кислой анилиновой краской - аурамином, благодаря чему туберкулезные ткани окрашиваются в три цвета: клеточная протоплазма - в желтовато-серый, клеточные ядра - в фиолетовый, а туберкулезные бациллы - в красный цвет. Для обесцвечивания кислоты не применяются. Сначала срез помещают в крепкий раствор гематоксилина или в более слабый раствор кампешевого экстракта по Клейну, с квасцами. Избыток краски удаляется промыванием водой, которую удаляют, погружая срез на недолгое время в абсолютный алкоголь. Срезы, окрашенные в фиолетовый цвет, переносят затем часа на два в фуксин, приготовленный следующим образом: насыщенный спиртовый раствор фуксина разбавляется смесью из равных частей однопроцентного раствора углекислого аммония и тимоловой воды. После того, как сильно окрашенные срезы промыты водой и обезвожены алкоголем, их на несколько минут помещают в анилиновое масло, затем в скипидар, и из последнего на несколько минут в ксилол, а через небольшой промежуток времени - в чистое анилиновое масло. После этого их помещают в концентрированный раствор аурамина в анилиновом масле , где они должны оставаться 10-15 минут. Из этого раствора их снова переносят в чистое анилиновое масло, затем в скипидар и ксилол, и, наконец, заключают в ксилоловый раствор дамаровой смолы. Описанный метод можно рекомендовать как лучший не только для исследования туберкулеза, но и для изучения взаимоотношений клеток с другими бактериями ("Фагоцитарная роль гигантских клеток при туберкулезе" (1888) - И.И.Мечников, Вопросы иммунитета (избранные труды), М., 1951, стр. 135-136
|
|
| |
Maxim | Дата: Четверг, 2010-07-29, 4:40 PM | Сообщение # 9 |
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Спасибо за цитаты. Интересно, но для сегодняшнего дня слишком мудренно и опасно. За это время я добыл немного немецкого порошка основного фуксина и сделал новый краситель. Гораздо четче видны бактерии и фон светелее и приятнее. Таким образом, мой краситель советского производства (начало 90-х) никуда не годится. Но в целом проблема остается. По хламидиям. Я пробовал много раз ШИК и даже как-то находил хлаиидии при окраске ШИК, но очень неуверен: сишком широкий спекрт веществ окрашивается по ШИК. У меня соменение в том, что при исследовании мазков-отпечатков и срезов с хламидиями они без проблем видны в мазках и отвратительно в срезах. Грам (красные), Гимза (синие) и ШИК не дают согласовванного понятия о наличии хламидий. Оставется топтаться возле гранулематозных процессов без указания возбдителя. Пробовал я и метиленовый синий - фуксин в разных вариантах (Павловский, Castaneda, Makkiavelli) - тоже все невнятное. Warthin-Starry красит остатки в макрофагах в черный цвет, но понять ничего нельзя.
|
|
| |
Чакона | Дата: Четверг, 2010-07-29, 8:16 PM | Сообщение # 10 |
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Maxim) У меня соменение в том, что при исследовании мазков-отпечатков и срезов с хламидиями они без проблем видны в мазках и отвратительно в срезах. Грам (красные), Гимза (синие) и ШИК не дают согласовванного понятия о наличии хламидий. А с чего Вы взяли, что на мазках - без проблем? Чувствительность окрашивания по Гимзе я уже назвал - 15-25% от случаев, выявленных иммуногистохимически. Куча артефактов и бессчетные ложнопозитивные результаты. Могу дать ссылку на конкретный (правда, не слишком доступный) источник, где это написано.
|
|
| |
Maxim | Дата: Четверг, 2010-07-29, 9:47 PM | Сообщение # 11 |
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Много раз видел и вижу пунктаты гранулематозных лимфаденитов (основная моя специальность - цитолог), где по Гимза ставлю подозрение на хламидии, рекомендую уточнить на ПЦР и практически в 90-95% они подтверждаются. А несколько раз был разный операционный материал (последний - подозрение на рак молочной железы), сделали отпечатки - 100% элеметнарные тельца + ретикулярные тельца, а в срезах ничем никак не смог подтвердить. Кстати ПЦР - хламидии. Вот патологи и постоянно теребят меня: вот тебе случай - ищи хладидии или вообще какой-нибудь инфекционный агент, раскрашивай как хочешь (так как все лаборанты заняты рутиной, обычно гистохимию крашу всегда сам). Вот и н начинаю: ШИК, Грам, Циль-Нильсен, Гимза, Гомори-Грокотт, Вартин-Старри, альциановый синий рН 2.5, метиленовый синий - фуксин. Разумеется, в партии для окраски добавляю положительные контроли. После этого гистохимического набора, если ничего не нахожу - сдаюсь. А хотелось бы иметь положительный результат. может быть, где-то это схема поиска инфекционного агента слаба? В чем? Что еще можно делать в рутине для пользы дела? За источник буду признателен. Попытаюсь найти.
|
|
| |
Чакона | Дата: Пятница, 2010-07-30, 8:34 AM | Сообщение # 12 |
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Maxim) Много раз видел и вижу пунктаты гранулематозных лимфаденитов (основная моя специальность - цитолог), где по Гимза ставлю подозрение на хламидии, рекомендую уточнить на ПЦР и практически в 90-95% они подтверждаются. А несколько раз был разный операционный материал (последний - подозрение на рак молочной железы), сделали отпечатки - 100% элеметнарные тельца + ретикулярные тельца, а в срезах ничем никак не смог подтвердить. Вы пишете о специфичности, а я - о чувствительности. Разные вещи. Что до источника - это методичка "Лабораторная диагностика хламидиоза", изданная в 1996г. кафедрой микробиологии Новокузнецкого ГИДУВ"а. Ссылаюсь на нее просто от того, что лежит у меня под рукой. На этой кафедре (а они занимаются также и диагностикой), уже давно оставили Гимзу и всегда для хламидий применяют иммунофлюоресценцию.
|
|
| |
Vladpatholog | Дата: Воскресенье, 2010-08-15, 5:36 AM | Сообщение # 13 |
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги! В зарубежной литературе повсеместно исользуется PAS реакция или acid Shiff, а на картинках что-то вроде ШИК-реакции. Это одно и то же или нет? И в чем суть этих реакций? Спасибо заранее.
|
|
| |
Maxim | Дата: Воскресенье, 2010-08-15, 9:14 AM | Сообщение # 14 |
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Vladpatholog! Вы совершенно правы, PAS = ШИК. PAS = periodic acid - Shiff. (перйодная кислота - реактив Шиффа). Часто эту реакцию называют окраской по Хочкиссу, Мак-Манусу, Шабадашу (есть небольшие отличия в этих методах, но суть их остается одинаковой). В приложении файл, в котором объясняется теория реактива Шиффа и один из методов окраски. В рутинной работе мы вобщем следуем этому протоколу, однако, пользуемся обычным гематоксилином Lillie, требующим последующей дифференцировки в солянокислом спирте (Mayer не требует дифференцировки). Перед ШИК-реакцией эти же срезы красим альциновым синим с рН 2.5 для окраски кислых мукополисахаридов (как Вы догадались, эта рутина для гастробиопсий). Никаких там сульфитных промывок и т.д. Для обычных рутинных целей этод метод вполне достаточный. Иногда патологи запрашивают эти окраски дополнительно вместе или по отдельности. Важно, чтобы реактив Шиффа хранился в холодильнике и имел светло-жетлый или белый цвет (а не красный или розовый!). Мы капаем его на срезы из пипетки и повторно не используем (хотя это и допускается).
|
|
| |
stas | Дата: Суббота, 2010-08-28, 7:22 AM | Сообщение # 15 |
Подполковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 24
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги, разрешите обратиться за советом. Нужна трихромная окраска для исследования нефробиопсий. Хочется в первую очередь четко видеть фибрин. Во всех руководствах микрофото окраски по Массону, однако эта окраска, требует дополнительной фиксации биоптата в фиксаторе Боуэна, что не есть для нас хорошо, так как, вполне возможно, в дальнейшем, материал подвергнется иммуногистохимическому исследованию. Подходит ли для исследования нефробиопсий трихромная окраска по Малори? Или есть другие методы окраски? Заранее благодарю за помощь.
|
|
| |
|
|