Красители для цитологии - Форум
 
Красители для цитологии - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2016-12-09, 10:43 AM

Страница 1 из 11
Форум » ОПЕРАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ » Методики » Красители для цитологии (вопросы цитологических окрасок)
Красители для цитологии
VladpathologДата: Суббота, 2010-08-14, 6:27 PM | Сообщение # 1
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Коллеги, нужны пошагово расписанные (приготовление рабочих растворов и т.п.) методики окраски мазков крови отпечатков л/у и мазков из костного мозга по:
1. May-Grunvald-Giemsa
2. Wright-Giemsa
Для меня важна правильность методики и воспроизводимость результата.
И если можно - в чем преимущества этих методов перед окраской только по Гимзе? Т.е. читая все эти методики не могу понять в чем разница результатов, возникает ощущение, что это все вариации, которые по сути ведут к идентичным результатам. С другой стороны не ясно - почему в одних книгах (например классификации ВОЗ) звучат именно May-Grunwald-Giemsa и Wright-Giemsa, а например в пособиях Bain указан просто Giemsa. К чему этот винегрет?
Заранее спасибо.
 
MaximДата: Воскресенье, 2010-08-15, 9:12 PM | Сообщение # 2
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
В приложении протокол моего рутинного метода цитологической окраски. Май-Грюнвальд - азур - эозин. Этим раствором красим все без исключения цитологические препараты с отличным качеством с 1993 года и по сей день.
Трудность окраски состоит в том, что сначала нужно оттестировать имеющиеся порошки. Попадаются партии просто гадкого азура II. Времени и сил уйдет достаточно, но результаты того стоят. Разумеется, сертифицированные красители лучше, но стоят очень дорого. Можно купить и готовые растворы типа Романовского и только разводить перед использованием.
Разницы в любом из методов азура и эозина практически не заметно. Она наступает, если рН растворов меняется, даже в одних и тех же растворах. Хорошо все написано в Лилли и Ромейсе.
Вся путаница в названиях возникает от того, что авторы ссылаются на разные источники Иногда и не подозревая о многообразии названий аналогичных методов. Если у Вас получается отличить синюю цитоплазму в лимфобластах от фиолетово-красных ядер, крупные и круглые оранжевые гранулы эозинофилов от мелкой красной зернистости в нейтрофилах, красные палочки Ауэра и фиолетово-синие гранулы мастоцитов - можете быть уверены, это залог правильного цитологического диагноза. Все остальные примеси в иде пигментов (гемосидерина и проч.) просто доказываются цитохимическими реакциями при необходимости.
Прикрепления: ---__.doc(34Kb)
 
VladpathologДата: Понедельник, 2010-08-16, 7:06 AM | Сообщение # 3
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Вот и у меня такое впечатление возникло - использую готовый реактив Биовитрума (Giemsa), аналогичные мазки на MGG ничем заметным не отличались. Хотя попробую по предоставленному протоколу (не уверен, что он аналогичен).
Спасибо.
 
VladpathologДата: Суббота, 2010-08-21, 7:32 AM | Сообщение # 4
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Изучил процедуру. Возник вопрос. Фактически приставка Май-Грюнвальд - отражает метод фиксации мазка, а Гимза это обычный раствор Азур-Эозина. А если пропустить этап фиксации в реагентах (т.е. упустить раствор Май-Грюнвальд) и приступить сразу к процедуре окраски после высушивания мазка? Просто я так на днях сделал - и все тоже самое. Вот и не понял - а к чему тогда фиксация в Май-Грюнвальде или других ему подобных?
Вот еще вопрос - я понимаю, что часто нет необходимости в длительном хранении, но все же. Почему мазки не покрывают стеклом? Взял пересмотреть у коллег цитологов - а они ну просто в безобразном состоянии, все в масле вымазаны - ну сплошной артефакт становится со временем. Свои препараты покрыл как обычные гистологические - ну тоже самое только аккуратнее и думаю долговечнее.
 
MaximДата: Воскресенье, 2010-08-22, 8:15 PM | Сообщение # 5
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Vladpatholog!
Вот один из достаточно профессиональных ответов на Ваш вопрос. Его я нвшел в FAQ-list J. Kiernan:
(Да не обидятся, те, кто не может прочесть по-английски - просто нет времени на перевод).

** Giemsa staining of blood smears: several hints

Question.

My methanol-fixed blood smears are not staining reliably
with Giemsa. Some advice is needed, please.

Answer

Fixation of well dried (at RT) PB smears can vary from 1-10
minutes; automated systems tend to use about 1-2 minutes and use
the methanol only once. For manual staining, most labs would fix
for about ten minutes. Precautions must be taken against
absorption of water from humid air. The methanol is usually
replaced twice daily, but more frequently at those times of
the year when humidity is high.

The first sign of unacceptable water content in the fixing
methanol will be the appearance of clear refractive spaces on
the biconvave surfaces of erythrocytes: perhaps only a few cells
per high-power field, but this will increase further as the
water content increases, and eventually the films will lose all
diagnostic value. Replacement of the methanol when you see more
than say 1-2/HPF might not be a bad idea. This artifact may also
be seen in some automated systems where the stain pack is not
turned over very quickly. Rather than replacing the stain pack,
economy of reagent can be maintained by manually fixing the
slides before thay go on the machine. This is particularly so
for the older Hematek grey models.

Caution. Longer fixation times are required for bone marrow
smears: 15-20 minutes, and always use fresh methanol for these.

Most persons using Giemsa prefer to stain the smear first with
May Grunwald or Jenner stain, either using it neat or diluting
1:2 with buffer. This pre-step improves the granule definition
and clarity, and also changes the traditional reddish purple of
nuclei with plain Giemsa to a blue purple as seen with Wright's
stain.

The selection of Sorensen's buffer will vary form 6.4-7.2, with
the lower pH being most popular with Wright's rather than
Giemsa. The aim is to select a pH that produces a colour balance
that readily allows the user to differentiate between
normochromic and polychromic red cells and to distinguish toxic
granulation when present, this is usually pH 6.8. If looking for
malarial parasites, then a pH of 7.2 is preferable because it
allows better contrast to detect chromatin dots, trophozioites
etc.

Прододжение следует.

Добавлено (2010-08-22, 8:15 PM)
---------------------------------------------
Вот продолжение

Dilution of the Giemsa solution is best done immediately before
use and will vary from 1:8 to 1:12 depending upon your protocol.
As a general rule of thumb the higher dilutions require longer
staining times of about 20 minutes, and the less dilute stains
need between 6 and 12 minutes, depending upon tthe quality of
the Giemsa. It was frequently claimed that the longer times gave
better definition, but I must admit that I've seen short timed
smears that are every bit as good.

For many years good quality Giemsa would be stable after
dilution for 6 to 8 hours. For the last 2 or 3 yrs, however, the
best you can hope for is 3 to 4 hours. After dilution the
solution starts to deteriorate, with the appearance of floccules
and a subsequent loss of staining ability or strength. As the
time progresses you may need to compensate by increasing the
staining time, but after 3 hours you will need to replace it.

Recipes for Giemsa vary, whether it be that of Hayhoe or of
Dacie & Lewis, and measurements may be by weight or volume.
Stock solutions that have a 50% by volume content of glycerol
(Analar or USP) are the most stable. Under no circumstances ever
heat your glycerol to more than 45C, even though most texts say
56C. Above these temperatures there is a risk of oxidation, even
in the stock solution, I use 45C as a cut-off point to give me a
safety margin. Dye content will also vary from 0.45 to 0.8%.
Lillie's comments should considered here. After standing for up
to 5 days, filtration to remove undissolved material is
essential.

Differentiation, by giving the slides two rinses in buffer of
two minutes each, is fairly standard, but you can overdo it. A
single rinse of three quick dips may in fact suffice. It will
depend upon your Giemsa solution and tastes. If overstaining is
a problem then consider adding methanol to your buffer rinse,
starting at 5% and adjusting according to results, followed by a
water rinse to remove solvent.

Mike Rentsch, "Histomail," Downunder
Ссылка: IHCWorld

 
VladpathologДата: Понедельник, 2010-08-23, 9:32 AM | Сообщение # 6
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
спасибо.
 
MaximДата: Понедельник, 2010-08-23, 11:14 PM | Сообщение # 7
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Vladpatholog!
Не поленитесь, откройте Ромейса в разделе "Исследование клетки и ее составных частей (окраска мазков крови)". Там четко описан смысл применения этих фиксаторов и разница между окраской с фиксатором и без. Это самая полная справка на сегодняшний день. Более полного и четкого представления об этом предмете мне в руки не попало. Буду балгодарен, если кто-нибудь даст ссылку на еще более подробные объяснения.

Спасибо за ссылку на FAQ-list через IHCWorld. Я нашел этот лист непосредственно на сайте J. Kiernan:
http://publish.uwo.ca/~jkiernan/faqlist.htm
Тогда, в 2001 году еще не был создан сайт www.ihcworld.com

Добавлено (2010-08-23, 11:14 PM)
---------------------------------------------

Quote (Vladpatholog)
Почему мазки не покрывают стеклом? Взял пересмотреть у коллег цитологов - а они ну просто в безобразном состоянии, все в масле вымазаны - ну сплошной артефакт становится со временем. Свои препараты покрыл как обычные гистологические - ну тоже самое только аккуратнее и думаю долговечнее

Уважаемый Vladpatholog!
Вы описали классический пример неряшливого отношения к своей работе. Не удивлюсь, если у них даже иммерсионное масло не вытирается с объектива х100 в конце рабочего дня.
После просмотра любой мазок прекрасно вытирается даже обычной сухой марлей или лучше мягкой салфеткой - будет менее травматично для материала на стекле. Сухие мазки хранятся очень долго без всяких сложностей и посмотреть можно в любое время. Если все же противно брать стекла в руки - сполосните стекло в ксилоле (чистом, ни в коем случае не с карбол-ксилолом) и заключите как обычное гистологической стекло в полистирол или другую нейтральную синтетическую среду (не бальзамы!). С таким препаратом можно обращаться как с обычным гистологическим стеклом. Желательно хранить в темноте (коробке со стеклами), чтобы со временм не выцвел на свету. И не давйте тем коллегам их в руки!
Я покрывал мазки даже просто полистиролм без стекла - прекрасно хранится уже много лет.
 
ЧаконаДата: Вторник, 2010-08-24, 0:15 AM | Сообщение # 8
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 105
Репутация: 5
Статус: Offline
Quote (Maxim)
заключите как обычное гистологической стекло в полистирол или другую нейтральную синтетическую среду

Я для этой цели когда-то использовал густое кедровое иммерсионное масло, как советовал Ромейс. Засыхает чуть дольше, чем бальзам, но сохранность окраски прекрасная.
 
MaximДата: Вторник, 2010-08-24, 6:29 AM | Сообщение # 9
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Quote (Чакона)
Я для этой цели когда-то использовал густое кедровое иммерсионное масло

Да, можно и иммерсинное, но это дороговатое удовольствие (не для отдельных стекол, а когда много). Дешевле вазелиновое. Но оно всегда жидкое, нужно окантовывать (лак для ногтей или тот же полистирол).
 
Форум » ОПЕРАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ » Методики » Красители для цитологии (вопросы цитологических окрасок)
Страница 1 из 11
Поиск: