ИГХ: с чего начать? - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Суббота, 2017-04-29, 6:32 AM

Страница 1 из 11
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » ИГХ: с чего начать?
ИГХ: с чего начать?
DR_PIXДата: Четверг, 2007-12-06, 1:16 PM | Сообщение # 1
Рядовой
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 10
Репутация: 1
Статус: Offline
Мне, как молодому врачу-патологоанатому, начальство поставило задачу оценить стоимость и возможность применения методов ИГХ в практике. Хотелось бы узнать, какое оборудование и реактивы необходимы на начальном этапе. Также буду благодарен за любые ссылки с указанием конкретных методик.
 
PatologoanatomДата: Четверг, 2007-12-06, 6:30 PM | Сообщение # 2
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 749
Репутация: 11
Статус: Offline
Уважаемый DR_PIX,
Спасибо за интерес к нашему сайту, надеюсь Вы будете постоянным участником.
Вы задаете классический вопрос. Когда-то начинал с этого вопроса, образенного к специалистам и получал ответ в виде встречных вопросов: "Каковы Ваши возможности и для чего это Вам надо?".

Начать надо с качественных препаратов с хорошими антигенными свойствами. В иммуногистохимии важен каждый шаг и может стать критическим: фиксация, проводка, нарезка, демаскировка антигенов, промывка в буферных растворах, выбор системы детекции, оценка...
Из отечественной литературы для начала порекомендовал бы статью из Архива Патологии.
В каталоге файлов нашего сайта, доступном для постоянных участников форума есть полезное англоязычное методическое руководство.
О расценках лучше спросить в ИГХ компании, см. ссылку.
Давайте продолжим обсуждение на форуме.

 
DR_PIXДата: Среда, 2007-12-12, 9:56 AM | Сообщение # 3
Рядовой
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 10
Репутация: 1
Статус: Offline
Благодарю за информацию, пойду изучать)

Добавлено (2007-12-12, 9:56 Am)
---------------------------------------------
Снова здравствуйте! Появился новый вопрос: при таком обилии онкомаркеров и антител к ним как выбрать методику (протокол) для диагностики? Конкретно для диагностики рака молочной железы и рака простаты.

 
niksavelovДата: Понедельник, 2007-12-17, 6:37 PM | Сообщение # 4
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Уважаемый DR_PIX,

Тут снова вопрос в цене вопроса. Если у Вас очень большой бюджет, что можно покупать готовые наборы реактивов для определения экспрессии рецепторов эстрогенов (ER) и прогестерона (PR) или с-erbB-2 (Her2/neu) – цена таких наборов в России более 2000 евро каждого (набор обычно рассчитан на 35-50 тестов). Если таких денег нет, то можно любой существующий в лаборатории протокол модифицировать для определения рецепторного статуса рака молочной железы. Не важно какими реактивами Вы пользуетесь, важно что бы результаты реакции отражали реальные биологические характеристики опухоли. Так, например, экспрессия рецепторов эстрогенов подчиняется закону “всё или ничего”. Иными словами результаты реакции должны иметь бимодальной распределение (см. ссылку). В этом есть биологический смысл – не бывает опухолей немножко гормон-чувствительных.

http://ajcp.metapress.com/app/home/linking.asp?referrer=linking&target=contribution&id=HCF035N9WK40ETJ0&backto=contribution,1,1;searcharticlesresults,2,3;

На сколько я знаю, для определения чего бы то нибыло в раке предстательной железы наборов не существует. Относительно протокола – тут надо избегать использования стрептавидин-биотиновых систем детекции. Иначе вместо исследуемого антигена могут окрашиваться митохондрии, содержащие большое количество эндогенного биотина.

Успехов.


Никита Савёлов
 
PatologoanatomДата: Среда, 2007-12-19, 4:48 AM | Сообщение # 5
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 749
Репутация: 11
Статус: Offline
Уважаемый niksavelov,
спасибо за развитие темы. Подскажите пожалуйста исходные данные статьи на которую Вы дали ссылку, не смог найти.
Тема количественной и полуколичественной оценки ИГХ окрашивания очень интересна. Наверное нам надо открыть специальный топик. Насколько понимаю, нет универсальной системы подсчета (IHC scoring system). Пороговая величина в 10% для ER также оспаривается некоторыми авторами.
 
niksavelovДата: Среда, 2007-12-19, 7:40 AM | Сообщение # 6
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Уважаемый Patologoanatom,
Да, со ссылками на статьи из American Journal of Clinical Pathology всегда творится какая-то ерунда. Много раз замечал, что они не живут более суток! Поэтому привожу исходные данные:

American Journal of Clinical Pathology; Vol 123, Num 1, pages 16 – 20
Bimodal Frequency Distribution of Estrogen Receptor Immunohistochemical Staining Results in Breast Cancer
Laura C. Collins, Maria L. Botero, Stuart J. Schnitt.
Для бесплатного получения статьи можно пойти по приведённой ранее ссылке, а затем ввести в строку для поиска первые три слова из названия статьи.

Я тоже думаю, что имеет смысл открыть для этой темы специальный топик. Но он, к сожалению, будет иметь чисто теоретическое значение. Ведь общая идеология оценки прогностических и предсказательных факторов сводится к тому, что отделы патанатомии в каждом медицинском учреждении должны вырабатывать свои шкалы оценки, которые коррелируют с чувствительностью к применяемым в данных учреждениях схемам химиотерапии. Для этого, в идеале, необходимо в каждом учреждении проводить ретроспективные исследования. Это связано с тем, что реальный порог оценки очень сильно зависит от методики ИГХ-окрашивания, применяемой в данном учреждении. Кроме того, выбор шкалы оценки зависит ещё и от привычек клиницистов. В нашем учреждении (РОНЦ) оценка рецепторного статуса рака молочной железы проводится давно. Наши клиницисты уже привыкли к оценке по 300-бальной шкале (Н-баллы), и не дают перейти на более правильную (с моей точки зрения) 8-бальную шкалу (Allred score).
Поэтому предлагаю открыть топик по оценке ИГХ-реакций вообще, как количественной, так и качественной.

Добавлено (2007-12-19, 7:40 Am)
---------------------------------------------
Прошу меня извинить - в предыдушем сообщении не прописан год публикации - 2005.


Никита Савёлов
 
VladpathologДата: Среда, 2007-12-19, 2:37 PM | Сообщение # 7
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Публикация вполне открывается. Спасибо. Почитал. У нас в отделении используют как раз 8-бальную шкалу оценки и я бы не сказал, что у нас имеются такие вот диаметрально противоположные результаты. Так вот имею сейчас под рукой небольшой фрагмент базы данных по молочной железе - всего 480 исследований (примерно треть за 1 год) и вот, что имею:
реакция 0-2 = 53,27% случаев,
реакция 3-5 = 21,83%
реакция 6-8 = 24,89%
Но это предварительные данные (на скорую руку)
Но я так понимаю не столь важно по какой системе оценивать. Здесь, по всей видимости, большя роль отводится взаимопониманию между клиницистами и патологами - т.е. отношению к степени выраженности реакции (ее интерпритации патологом) со стороны лечащего врача.
 
niksavelovДата: Среда, 2007-12-19, 5:23 PM | Сообщение # 8
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Уважаемый Vladpatholog,
Наши данные по распределению экспрессии рецепторов эстрогенов, к сожалению, привести не могу т.к. сам определяю их в основном не в первичных опухолях, а в метастазах аденокарцином без выявленного первичного очага у женщин. Интересно, а какое распределение у Вас получится если сделать группы 0-2, 3-6, 7-8?

Работ, в которых говорилось бы о бимодальном распределении экспрессии рецепторов эстрогенов довольно много. Но интересно отметить одну деталь. Среди тех работ, где методика описана более или менее подробно, бимодальное распределение получается в лабораториях, использующих либо высокочувствительные системы детекции, либо амплификацию сигнала после окрашивания диаминобензидином. Понятно, почему так происходит – даже слабо экспрессирующие опухолевые клетки окрашиваются с максимально возможной интенсивностью (практически достигают плато интенсивности окраски). Вопрос в другом – правильно ли так красить? Оценивать то реакции понятно удобнее, когда они подчиняется закону “всё или ничего”. Но не теряется ли при этом реальная картина? Ведь внутриопухолевая гетерогенность экспрессии практически любых белков больше чем среди нормальных клеток-аналогов. С другой стороны, учитывая моноклональное происхождение опухолей, если в опухоли есть экспрессия рецепторов эстрогенов, то она должны быть практически во всех клетках, а 7 баллов как раз и говорят о внутриопухолевой гетерогенности. Может эта ситуация и отражает реальную картину, а способность получить бимодальное распределение экспрессии рецепторов эстрогенов в раке молочной железы может являться критерием качества работы ИГХ-лаборатории?


Никита Савёлов
 
VladpathologДата: Четверг, 2007-12-20, 4:39 PM | Сообщение # 9
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Касательно систем, то мы как помнится пользуемся Envision plus duo от дако. Вроде все хорошо получается, сертификацию на енто дело наши специалисты в свое время проходили в Герцена. И как помнится и там о бимодальности речи не шло. Конечно можно попытаться искусственно услить результат окрашивания. Вот только не понятно зачем это нужно?
 
PatologoanatomДата: Четверг, 2007-12-20, 8:50 PM | Сообщение # 10
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 749
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (Vladpatholog)
Конечно можно попытаться искусственно услить результат окрашивания.Вот только не понятно зачем это нужно?

Уважаемый Vladpatholog, иногда существует такая необходимость, особенно при работе с архивным материалом из различных учреждений, при отсутствии стандартизации процедур (например неизвестной давности фиксации в формалине).
Другое дело, что такой усилитель тоже должен быть стандартизирован. Одним из оптимальных систем считается автоматизированная иммуногистохимия, и хорошие, воспроизводимые результаты дает Bond™(Vision BioSystems™). "Вытаскивает" специфическое ИГХ окрашивание из почти безнадежных образцов.
 
niksavelovДата: Воскресенье, 2007-12-23, 1:37 PM | Сообщение # 11
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Ну вот, мы снова вернулись к теме “ИГХ. C чего начать?”.
Вопрос конечно не только в цене вопроса, но и характере материала с которым придётся работать. Если это только “домашний” материал, то тут, что называется, “своя рука владыка”, ибо если есть какие-то проблемы с антигенной сохранностью, то можно и фиксацию и протокол заливки в парафин подкорректировать. Если доля консультативного материала в лаборатории велика, то, в этой ситуации, чувствительность используемых методов должна быть максимальной. Для увеличения чувствительности методики можно применять два, с моей точки зрения, альтернативных подхода: либо увеличить количество антигенных детерминант в ткани (например, проводить демаскировку в буферах с высокой рН (8.0-10.0), либо использовать высокочувствительные системы детекции. В нашей лаборатории мы идем преимущественно по второму пути. Лишь для очень небольшого количества антигенов использование двухступенчатой полимерной системы детекции и демаскировки антигенов в Tris/EDTA, pH=9,1 приводит к дополнительной интенсификации окрашивания. Для выявления подавляющего числа антигенов достаточна комбинация двухступенчатой полимерной системы детекции и демаскировки антигенов в каком-нибудь модифицированном цитратном буфере (типа Citra plus (BioGenex) или цитратный буфер (S1699, Dako). Кроме того, использование для демаскировки буферов с низким рН лучше сохраняет морфологию ткани, что бывает очень актуально при работе с консультативным материалом.
Относительно же Envision plus duo от дако, могу сказать, что мы тоже долго работали с Envision plus. Даже используя её можно получить бимодальность экспрессии ER изменяя концентрацию первых антител. Однако, сделать это не просто, т.к. системы детекции Envision – это, исторически, одни из первых (если вообще не первые) полимерные системы детекции. Они одноступенчатые, в них пероксидазы и вторые антитела “сидят” на декстрановом полимере средней молекулярной массы. Получается очень громоздкий, высоко гидратированный, полимер, который плохо проникает в клетку. Поэтому системы детекции Envision обладают едва ли не самой низкой чувствительностью среди полимерных систем детекции, присутствующих на рынке сегодня. Для того, что бы исправить ситуацию Dako идёт по первому пути – для многих антигенов рекомендует демаскировку в буферах с высоким рН. Мы же в свое работе пользуемся двухступенчатой полимерной системой детекции Super Sensitive™ Polymer-HRP IHC Detection System/DAB (BioGenex) – название чем-то напоминает названия Никон’овских объёктивов. Эта двухступенчатая система детекции чувствительнее Envision plus, по нашим данным, приблизительно в семь раз (в зависимости от выявляемого антигена, конечно). Bond™(Vision BioSystems™) сопоставима с Super Sensitive™ Polymer-HRP… по чувствительности.


Никита Савёлов
 
DR_PIXДата: Среда, 2007-12-26, 1:08 PM | Сообщение # 12
Рядовой
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 10
Репутация: 1
Статус: Offline
Доброго времени суток, уважаемые коллеги!. приятно видеть, что вопрос новичка вызывает такое серьезное обсуждение. Нет ли у кого-нибудь ссылок на русскоязычные руководства? Просто мой начальник не читает на английском и мне приходится все переводить вручную... 2000 долларов на реактивы конечно никто не даст(( такая вот ситуация, придется либо подыскивать что-то подешевле, либо отказаться от применения ИГХ, хотя самому очень хотелось попробовать.
 
PatologoanatomДата: Понедельник, 2008-01-14, 4:18 AM | Сообщение # 13
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 749
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (DR_PIX)
Нет ли у кого-нибудь ссылок на русскоязычные руководства?

Уважаемый DR_PIX,
Хорошее руководство в котором толково описана методология ИГХ и другие методы: Молекулярная клиническая диагностика. Методы.
Чтобы найти электронную версию нужно провести поиск в сети с по ключевым фразам: Молекулярная клиническая диагностика. Методы скачать djvu
Начните с Яндекса.
 
niksavelovДата: Понедельник, 2008-01-14, 7:09 AM | Сообщение # 14
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Книга действительно толковая, но очень устаревшая.

Никита Савёлов
 
PatologoanatomДата: Понедельник, 2009-04-06, 6:41 PM | Сообщение # 15
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 749
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (DR_PIX)
Нет ли у кого-нибудь ссылок на русскоязычные руководства? Просто мой начальник не читает на английском и мне приходится все переводить вручную...

Для осваивающих методку: "Основы иммуногистохимии" на сайте компании БиоВитрум. Успехов!

Прекрасная статья, позволяющая понять основы ИГХ.

Сообщение отредактировал Patologoanatom - Понедельник, 2009-05-25, 7:44 AM
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » ИГХ: с чего начать?
Страница 1 из 11
Поиск: