Вы вошли как Гость Текущая дата: Пятница, 2024-03-29, 2:33 PM
Демаскировка антигенов
|
|
Patologoanatom | Дата: Вторник, 2006-10-03, 2:33 AM | Сообщение # 1 |
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Quote (Vladpatholog) | Ну вот и на моей улице праздник - бюро приобрело ретривер - Наконец-то срезы не отваливаются от стекол! видимо в микроволновке (даже как-то неудобно говорить о том, что мы ей пользовались до сих пор) не хватало давления. | Уважаемый Vladpatholog, Термическая обработка гистологических срезов в микроволновой печи с целью демаскировки антигена - не такая уж и плохая методика. Иммуногистохимия, как и любая изысканная кухня требует творческого подхода. Следует учитывать тип буферного раствора, его pH, искомый антигенный эпитоп. Большинство компаний производителей антител снабжает специалистов информацией о рекомендуемом типе обработки ткани (энзиматическом, тепловом), буферном растворе с учетом типа фиксатора и тканевой обработки. В разных случаях требуются разные методы. Например для ИГХ окрашивания с одним антителом лучше использовать обработку в водяной бане, с другим микроволновка, а с другими рисоварка или пароварка. Звучит забавно, но это так. Кроме того каждый раз рекомендуется титровать антитела. Для избежания отскакивания материала от стекол требуется применение положительно заряженых предметных стекол (с меткой x в нижних углах) или обработанных полилизином. Лучше использовать стандартизованные протоколы, но каждая лаборатория имеет свои секретные рецепты.
Сообщение отредактировал Patologoanatom - Вторник, 2006-10-03, 2:36 AM |
|
| |
Roman | Дата: Понедельник, 2011-01-24, 11:32 PM | Сообщение # 31 |
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Спасибо за ответ, но остались вопросы при ручной работе 1. все таки вода не полностью заменяет буфер? или можно только с водой на всех этапах? 2. отмывка по 1 мин в каждой смене буфера и воды? 3. и вопрос дилетанта полимерная система детекции это, например, Envision? или другая?
От всего человека вам остается часть... И. Бродский
|
|
| |
Maxim | Дата: Вторник, 2011-01-25, 0:04 AM | Сообщение # 32 |
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Roman! 1. Rodney Miller (Propathlab) и Dave Tasha (BioCare), которые предложили этот метод промывки водой с твином - люди, конечно, видные. Однако, за ними мало кто последовал с 2001 года. И не опубликованы количественные оценки - только впечатления. Это настораживает. Я избегаю всякой воды даже после пероксидазного блока. В других рукодствах (Abcam) пишут, что TBST наоборот защищает от фонового окрашивания. У Dabbs 2010 тоже что-то про воду ничего не сказано, да и Boenisch в даковских брошюрах (4-5 изд) воду не рекламирует и т.д. 2. Я вручную промываю TBST из пипетки 3-4 раза по 3 мл между всем этапами ИГХ. Никакого фона или что-то в этом роде. Часто следы диффузии антигена заметны от неадекватной фиксации. Наши онкологи любят нам доставлять отвратно фиксированный материал (ничего не можем поделать пока). 3. Полимерные системы: EnVision, EnVision+, Dako dual link, FLEX, Ultra Vision, Novolink, Histofine, Biogenex, DBS, и другие. производители ВСЕГДА пишут о типе системы и в рекламме и во вкладышах.
|
|
| |
niksavelov | Дата: Вторник, 2011-01-25, 0:36 AM | Сообщение # 33 |
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| 1. Когда я работал вручную, то кажется использовал буфер только при отмывке полимера, меченного пероксидазой. Т.е. перед DAB. Помню, что при окраске до 500 стёкол в неделю (в одной комнате работало тогда две группы - по эпителиальным опухолям и гематологи) уходило лишь 5-6 л. буфера! Т.е. примерно 10 мл. на стекло. Тогда отмывка происходила в сосудах Хелендахеля. В один сосуд помещалось 15 стёкол и примерно 70 мл. буфера. 70 мл./15 стёкол ~ 5мл. Отмывка была 2 раза по 5 мин. Вроде всё сходится. Всё остальное отмывалось в дистилляте с твином. Но это всё было 2.5 года назад, да ещё и в другом учреждении. Поэтому некоторые детали я мог уже подзабыть. 2. Нет, не по одной минуте. Вручную лучше делать по 5 мин. два раза после каждой инкубации чего-либо. В нашем стейнере всё нескольк сложнее. Реально получается минуты по три-четыре, поэтому и три отмывки стоит. Я пробовал программировать стейнер делать отмывку по 5 мин., но если это плохо вписывается в общую схему протокола (например, при разном времени инкубации первых антител на разных стёклах), то стейнер сокращает время отмывки т.к. в нем запрограммирован приоритет времени инкубации. Поэтому и пришлось для надёжности делать три смены (дополнительно поставить буфер), в чём при ручном окрашивании нет необходимости. 3. Envision - это самая низкочувствительная полимерная система детекции существующая на рынке в настоящее время. Даже Envision FLEX+ не сильно лучше! Мы пользуемся UltraVision Quanto от Thermo Scientific. Хотя я ради интереса перепробовал почти все полимеры, которые можно было купить в России, а так же некоторые, которые здесь никогда не продавались (ADVANCE, например от Dako). Добавлено (2011-01-25, 0:36 Am) --------------------------------------------- Ну вот, как всегда опоздал с ответом. Пока писал Maxim уже всё прокомментировал! На этом месте хотелось бы сделать пару ремарок: Quote (Maxim) Biogenex, DBS - это название компаний, а не систем детекции. Но полимерные системы есть и у этих производителей. Много лет я предпочитал именно полимерники от BioGenex. Quote (Maxim) да и Boenisch в даковских брошюрах (4-5 изд) воду не рекламирует - Во первых Boenisch уже Retired consultant! Его идеология как методиста очень сильно расходится с идеологией Dako, что очень хорошо видно из его статей в AIMM. Кроме того, он в руководствах писал лишь первые три общие главы, а отмывка в пятом, например, издании руководства разбирается подробно в 16 главе совершенно другим человеком.
Никита Савёлов
|
|
| |
Roman | Дата: Вторник, 2011-01-25, 7:32 PM | Сообщение # 34 |
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Уважаемые Maxim, и niksavelov, спасибо за обстоятельные ответы. вот так и обрастаешь знаниями. извините за дотошность промывать вручную, если не из пипетки,а в бюксах по пять минут, то все это время полоскать или можно оставить их без движения? Водой все таки попробую для экономии буфера, все у нас приходиться экономить. И систему детекции надо менять.
От всего человека вам остается часть... И. Бродский
|
|
| |
Maxim | Дата: Вторник, 2011-01-25, 8:43 PM | Сообщение # 35 |
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Roman! Промывка в бюксе (он же стакан для окраски) - медленные круговые движения стеклом 5-8 движений и затем перенести в другой сткан. Стекла оставлять так, чтобы срезы не касались других стекол. По 2 стекла (back-to-back) не переносить, только по одному. После второго стакана можно переставить и в третий (если будете в воде промывать). Первый стакан вылить, остальные передвинуть влево - последний свежий после каждого этапа окраски. Достаточно подержать их в свежей воде с твином не менее 2-3 минут. Вынимая также можно сделать 2-3 не быстрых макащих движения. Это достаточно качественная промывка. Вы сэкономите уйму времени, если возьмете полистироловую планшетку для стекол (кажется Биовитрум продает такие по 80р) и разрежете на 2 части по 10 стекол и поставите ее во влажную камеру. Стекла будет удобно брать руками и ставить назад. После промывки эту мини-планшетку поставьте примерно под 45оС и промокните под срезами скапливающиеся капли, верните в горизонтальное состояние и нанесите реагенты (блок, а/т, систему, ДАБ). Поставьте обратно в камеру. Быстрее, чем возиться с каждым стеклом и раскладывать на стеклянные салазки? Планшетку можно использовать для этапов от пероксидазного блока до ДАБ. Все остальные этапы спокойно выполняются в обычных стойках для окаски. Кстати, о мытье. Посуду для ИГХ нельзя мыть хлорсодержащими моющими средствами, поскольку остатки хлора инактивируют любые белки. Или промывайте основательно проточной и потом дистиллированной водой.
|
|
| |
Anitra | Дата: Среда, 2011-07-20, 0:10 AM | Сообщение # 36 |
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Статус: Offline
| Добавлю про системы детекции - сейчас на рынке есть не только полимерные, но еще дальше шагнувшие системы детекции.
Если не ошибаюсь там используются так называемые линкеры (long-arm linkers). Представляют из себя небольшую линейную молекулу с HRP на конце. В отличии от полимерной системы детекции значительно более чувствительны из-за размера молекулы (в справнении с полимером как у Даковской системы) плюс картинка получается "в фокусе" - гораздо более резвкая, опять же, из-за того что сигнал не размазывается, а более локальный.
Да и стоят они дешевле полимерных (что кстати удивительно, но приятно!)
Червяк длинный, а жизнь короткая
|
|
| |
niksavelov | Дата: Среда, 2011-07-20, 10:44 AM | Сообщение # 37 |
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Quote (Anitra) В отличии от полимерной системы детекции значительно более чувствительны из-за размера молекулы (в справнении с полимером как у Даковской системы) А есть ли какие-либо научные публикации на эту тему в реферируемых журналах? Или информация почерпнута только из Абкамовских и Спринговских рекламных брошюрок?
Кроме того, сравнивать любые современные полимерные системы детекции или системы с long-arm linkers с Доковскими декстрановыми полимерами вообще не очень честно что ли. У Дако были первые полимерные системы детекции, появившиеся на рынке (90-е годы ХХ в.). Тогда это была революция т.к. среднемономолекулярные декстраны не реагируют ни с какими компонентами человеческих тканей, т.е. сами по себе не дают фонового окрашивания. EnVision - одноступенчатая система, т.е. была экономия времени. Но Даковцам не повезло - декстраны сильно гидратируются, что значительно увеличивает размер молекулярного комплекса. Поэтому EnVision и её дочки (Advance и FLEX) плохо проникают через билипидные слои клеточной и ядерной мембран. Особенно это становится критичным при исследовании ядерных антигенов. Т.е. результат сравнения любых современных полимерных или long-arm linkers-содержащих систем детекции с декстрановыми заранее известен - декстановые (за исключением EnVision FLEX+) менее чувствительны (см., например, http://www.nordiqc.org/seminars/Krakow-10/Krakow-SN-2010.pdf - таблица на стр. 6). При разработке своих полимерных систем конкуренты Дако этот факт учитывали. Поэтому декстраны больше никто в полимерных системах не использует. Все остальные полимерные системы детекции компактнее, а следовательно чувствительнее чем EnVision. Поэтому сравнивать Абкамовский EXPOSE или Спринговский REVEAL надо с какой-нибудь полимерной системой детекции с мелким полимером (например, с UltraVision Quanto от Thermo Fisher Scientific).
Никита Савёлов
|
|
| |
Anitra | Дата: Среда, 2011-07-20, 11:53 PM | Сообщение # 38 |
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Статус: Offline
| Quote (niksavelov) А есть ли какие-либо научные публикации на эту тему в реферируемых журналах? Или информация почерпнута только из Абкамовских и Спринговских рекламных брошюрок?
Информация почерпнута из рекомендаций коллег и последовавшего за ними личного опыта. Но думаю я задамся целью и поищу статьи. Кроме того, у меня есть подозрения что Ventana использует именно эти системы детекции в своих приборах (думаю что это Spring). А они ребята привередливые...
Quote (niksavelov) Кроме того, сравнивать любые современные полимерные системы детекции или системы с long-arm linkers с Доковскими декстрановыми полимерами вообще не очень честно я привожу такое сравнение только исходя из того, что Дако в России очень долго был моноволистом на рынке, и большинство сидят именно на их системах детекции. Но прогресс не стоит на месте и никого не щадит. А вот информационная коммуникация страдает. Маловато меропиятий где можно безболезненно почерпнуть новинки и перенять опыт. Вот и используют то к чему привыкли...
Червяк длинный, а жизнь короткая
|
|
| |
niksavelov | Дата: Четверг, 2011-07-21, 9:41 AM | Сообщение # 39 |
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Да, совсем забыл про Вентану. У них то же long-arm linkers в ultra View используется. Возможно и Спринговская, не знаю. С ultra View есть опыт работы. Какой-то уж очень высокой чувствительностью эта система не обладает. Через пару недель планирую сравнить её в прямых тестах с UltraVision Quanto. Результатом поделюсь на форуме обязательно. При всей привередливости Вентаны ничего нового в их подходах к этапам иммунного окрашивания не наблюдается. Суммарная чувствительность протоколов у них складывается из демаскировки в растворе с EDTA (СС1), подогреве стёкол при инкубации антител и системы детекции, и достаточно современной системы детекции. Все те же принципы реализованы, например, в автостейнерах Bond (Лейка), которые есть на российском рынке.
Никита Савёлов
|
|
| |
Anitra | Дата: Четверг, 2011-07-21, 1:56 PM | Сообщение # 40 |
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Статус: Offline
| niksavelov, ну не скажите... в вентане есть несколько ноу-хау - жидкое покровное стекло, воздушный вортекс Подогрев каждого стекла индивидуален, в отличии от Бонда, где разбивка идет по планшетам, что позволяет запускать одновременно всего 3 протокола, а Вентане при желании можно и 30 запустить. + у Бонда эта дикая система кавертилей - нахлобочки на стекла предотвращающие высыхание - каждую можно использовать строго 25 раз, они царапаются, ломаются, к ним прилепают срезы и трескаются слайды. У нас это все не будет работать. Я очень скептически к Бонду отношусь. Кстати, Бонд это единственный приближенный аналог вентаны. Больше на рынке нет пока приборов которые делают все от депарафинизации до подкраски. Вот когда X-Matrix выйдет, тогда будет о чем поговорить. Но индусы его родить не могут уже очень давно. Остальные аппараты - что Дако, что Термо, что BioCare - простые капалки...
Кстати демаскировка в Вентане делается не только СС1 (это кстати трис-буфер). У них есть еще СС2, есть ферментная демаскировка, можно их комбинировать... Тот же пан-кератин получается очень круто если делать СС1 + Протеаза. Просто заглядение. А если не комбинировать - есть неспецифика. Ручами обычно в лабораториях не очень любят с ферментами возиться.
Вы планируете вентановскую или спринговскую систему с Ультравижн сравнивать? Разве вентановскую систему можно достать отдельно от вентаны? результаты были бы очень интересны. Жду с нетерпением.
Червяк длинный, а жизнь короткая
|
|
| |
niksavelov | Дата: Четверг, 2011-07-21, 3:59 PM | Сообщение # 41 |
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Жидкое покровное стекло, воздушный вортекс - эти технологии не имеют прямого отношения к самому иммунному окрашиванию. Эти ноу-хау имеют отношение исключительно к функционированию самой железяки (автостейнера), которая у Вентаны скофигурирована далеко не лучшим образом. Для обсуждения железа предлагаю открыть отдельную ветку форума. Я, например, к Бонду менее скептически отношусь. Да и простые капалки сейчас довольно надёжны и в плане работы, и в плане результата.
Но мы не об этом, а об окрашивании. Много в Вентане протоколов для ИГХ, в которых используется CC2? Они почти все, за редким исключением, используют СС1. А СС1 - это Tris/EDTA (то, что в каталоге Вентаны написано, что СС1 is a tris-based buffer ещё не говорит, что в нём нет EDTA). Редкие исключения о которых я говорил касаются CC1+протеза. Протеаза по большому счёту в современной ИГХ не очень нужна. Мы вообще обходимся без протеазы. Просто подбираем клоны антител, которые дают хорошие результаты при демаскировке в буферах с EDTA или с цитратом.
С UltraVision Quanto собираюсь сравнивать Вентановскую систему. Достать её отдельно от Вентаны я не пытал. Нам её поставляют к Вентановскому автостейнеру.
Никита Савёлов
|
|
| |
Zayok | Дата: Четверг, 2014-12-18, 10:26 AM | Сообщение # 42 |
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 1
Статус: Offline
| Прошу помощи. нам в лабораторию поступила новая система визуализации DAKO FLEX En Vision. в каком количестве добавлять EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) на 1 л дистиллированной воды? EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) 50 мл раствора на 950 мл дистиллированной воды? буду очень благодарна.
|
|
| |
Maxim | Дата: Четверг, 2014-12-18, 9:33 PM | Сообщение # 43 |
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Zayok, с концентратами все очень просто. 50х озанчает, что вы должны 1 часть концентрата развести в 49 частях воды. Или 1 мл концентрата + 49 мл воды. Литр еще проще: 1000 мл / 50 = 100/5=20. Т.е. 20 мл концентрата 50х + 980 мл деионизированной воды (или еще говорят, долить до литра). 20х озаначет: 1 часть концентрата + 19 частей воды. На литр: 1000/20=100/2=50 мл концентрата 20х + 950 мл воды. 10х: - 1 часть концентрата + 9 частей воды. Часть может быть млиллитром, литром и т.д. Для демаскировки в зеленых пластиковых емкостях достаточно 150мл демаскирующего раствора. Тогда потребуется 3 мл концентрата 50х + 147 мл воды, в случае концентрата 10х: 15 мл концентрата + 135 мл воды. При окраске вручную на промывку каждого стелка досаточно потратить 3 мл промывочного раствора. Я трачу для послного цикла окраски ИГХ 20 стекол 750 мл разведенного промывочного буфера (сюда входит промывка после демаскировки, все этапы ИГХ и подсинивание гематоксилина). Вся трудность в отмеривании нужного количества жидкости. Обязательно используйте калиброванную по ГОСТ посуду. Как правило, это стеклянная посуда. Мне не попадалась пластиковая тара, калиброванная по ГОСТ. Так как все калибруется по деионизированной воде, а потом меряется по соотвествующим штрихам на шкале предлагаю все упросить для целей ИГХ. Плотность концентратов условно можно считать равной 1, так же как и воды. То, есть, будет гораздо точнее, если вы будете мерять количество воды не по штрихам (особенно неудобно это делать в высоких мерных цилиндрах), а просто взвешивая соответстующее количество на электронных лабораторных (калиброванных) весах с точностью до 2 знака после запятой. Такие весы не дороги, но очень удобны в рутинной работе. Вы потратите несколько секунд на взвешивание, количество отмеряете точнее, чем по штрихам, а тара может быть той, которая удобна или необходима вам, без всяких рисок и калибровок. Я давно отказался от мерных стаканов и цилиндров. Система FLEX работает вполне хорошо. Каждый раз внимательно читайте надписи о концентрации на флаконах. У Дако есть и готовые растворы для демаскировки.
|
|
| |
|
|