используем CD172a (SIRP) клон ОХ41 производства Millipore. Там в спецификации рекомендована демаскировка трипсином или проназой. Трипсин мы выбрали наугад.

Maxim, спасибо за информацию. Что касается фиксации материала: срезы я готовила с одного и того же блока, а ткань выглядит по-разному в зависимости от времени инкубации с трипсином. По поводу второй возможности: а как правильно сушить срезы? Использовать инкубацию при комнатной температуре, честно говоря, даже в голову не пришло. Думала, что оптимальная температура для работы фермента именно 37 градусов? А промываем мы хорошо:)

1. Из работ Thomas Boenisch начала века я почерпнул идею, которой следую до сих пор: Никаких буферов до этапа первых антител! Он объясняет это тем, что любой буфер, по определению, изменяет конформацию антигенов, и часто совершенно не оптимальным образом. Т.к. большинство эпитопов с которыми приходится работать не линейные. а конформационные, то все этапы отмывки раствора для демаскировки и перекиси я провожу в дистилляте с твином.

2. Rodney T. Miller в своей знаменитой лекции 2001 года рекомендовал так же отмывку первых антител и системы делекции проводить в дистилляте с твином. Я так делал пока в лаборатории не появился стейнер LabVision, т.е. пока работали вручную и лаборант чётко соблюдал время и кратность отмывки. Наш иммуностейнер не очень чётко соблюдает время отмывки - для него время отмывки это "разменная монета" при оптимизации протокола окрашивания в целом. К тому же объём жидкости на стекле в стейнере не тот, что был у меня в контейнерах для отмывки. Поэтому сейчас я отмываю первые и вторые антитела по схеме: буфер-"вода"-"вода". И только полимер я мою двумя сменами буфера. Почему - сам не знаю. Как-то так исторически сложилось.

Пользуясь этой схемой, а так же использую полимерные системы детекции и титруя каждый лот антител я вообще забыл что такое фоновое окрашивание. единственный его сорт, который встречается пока ещё регулярно - это MAG (Mouse ascites Golgi).

Для начала необходимы некоторые вводные пояснения. У нас два протокола - с демаскировкой в буфере с рН=6.0 и 9.0. Тот что 6.0 - это Dako'вский S1699, а тот что 9.1 - это 3-в-1. Его готовим сами по прописи:

TE с Triton X-100, pH=9.1 (x1)

Tris Base 1.815 g 10 mM
EDTA Na2 0.555 g 1 mM
Triton X-100 7.5 ml 0.5 %
DI H2O up to 1500 ml.

При использовании протокола с рН=9.1 срезы из РТ-модуля (по-сути водяная баня с термоконтролером и вентилятором для охлаждения), в котором они охлаждаются после демаскировки до +65С, сразу переносятся в дистиллированную воду с 0.05% Tween20 (далее, для кратости, буду использовать просто термин "вода") на 10 мин при комнатной температуре. Этот перепад температур никак не влияет на адгезию ткани к поли-лизиновому стеклу (срезы ни разу не слетали). Объём "воды" в ванне - 1500мл. В этом объёме отмывается не более 72 стёкол. Я сейчас отмываю вообще лишь 36 стёкол в одной смене (одна загрузка стейнера = один рабочий день). Не по каким-то идеологическим причинам, а просто для воспитания в лаборанте культуры лабораторной работы - чтоб на неделю не оставляли. После этого срезы загружаются в стейнер, ещё раз смачиваются "водой" из бутылки с носиком, затем запускается протокол. Протокол идет по общей схеме: Вода--3% водный р-р перекиси водорода 15 мин.--вода--сыворотка животного из которого получены вторые антитела 5 мин.--вода--первые антитела 20-30 мин.--буфер--вода--вода--вторые антитела 10 мин.--буфер-вода--вода--полимер с пероксидазой--буфер--буфер--DAB 5 мин.--буфер--DAB 5 мин.--вода--медный купорос 5 мин.--вода и далее по списку (докраска ядер и т.д.).

При использовании Dako'вского буфера для демаскировки с рН=6.0 протокол несколько отличается, но не принципиально в отношении использования "воды".