Демаскировка антигенов - Страница 2 - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Четверг, 2017-07-27, 1:32 AM

Страница 2 из 3«123»
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Демаскировка антигенов
Демаскировка антигенов
PatologoanatomДата: Вторник, 2006-10-03, 2:33 AM | Сообщение # 1
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 750
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (Vladpatholog)
Ну вот и на моей улице праздник - бюро приобрело ретривер - Наконец-то срезы не отваливаются от стекол! видимо в микроволновке (даже как-то неудобно говорить о том, что мы ей пользовались до сих пор) не хватало давления.

Уважаемый Vladpatholog,
Термическая обработка гистологических срезов в микроволновой печи с целью демаскировки антигена - не такая уж и плохая методика.
Иммуногистохимия, как и любая изысканная кухня требует творческого подхода. Следует учитывать тип буферного раствора, его pH, искомый антигенный эпитоп. Большинство компаний производителей антител снабжает специалистов информацией о рекомендуемом типе обработки ткани (энзиматическом, тепловом), буферном растворе с учетом типа фиксатора и тканевой обработки. В разных случаях требуются разные методы. Например для ИГХ окрашивания с одним антителом лучше использовать обработку в водяной бане, с другим микроволновка, а с другими рисоварка или пароварка. Звучит забавно, но это так. Кроме того каждый раз рекомендуется титровать антитела.
Для избежания отскакивания материала от стекол требуется применение положительно заряженых предметных стекол (с меткой x в нижних углах) или обработанных полилизином.
Лучше использовать стандартизованные протоколы, но каждая лаборатория имеет свои секретные рецепты.


Сообщение отредактировал Patologoanatom - Вторник, 2006-10-03, 2:36 AM
 
PatologoanatomДата: Понедельник, 2007-01-22, 7:02 PM | Сообщение # 16
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 750
Репутация: 11
Статус: Offline
Уважаемый Roman,
Учитывая, что вы использовали антитело, не разработанное специально для исследований тканей животного, следует сказать, что окраска получилась хорошая. Окрашивание трофобласта возможно произошло из-за перекрестной реакции антигенов и антител. Наверное не стоит сильно улучшать окрашивание, можно только попробовать усилить блокирующие процедуры перед наложением первичного антитела (метанол с перекисью водорода 0,004% на 10 минут, купание стекол в 5% растворе обычного разведенного сухого молока на 20 мин из пакета и пероксидазный блок на 5 мин из набора EnVision+ , если вы используете эту систему детекции).
При подсчете сосудов, можно просто пренебречь реакцией со стороны клеток трофобласта и клеток воспалительного ряда.


Сообщение отредактировал Patologoanatom - Пятница, 2007-10-05, 10:49 PM
 
RomanДата: Суббота, 2009-10-10, 6:17 PM | Сообщение # 17
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Уважаемые коллеги, хотелось бы продолжить обсуждение.
И спросить у более опытных коллег - существует ли какой-либо алгоритм по выбору метода демаскировки?


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
VladpathologДата: Суббота, 2010-02-13, 8:29 AM | Сообщение # 18
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Появилось обновление в каталоге файлов. Подробно описан метод калибровки микроволновой печи, используемой для восстановления антигенов в ходе проводки материала при ИГХ-исследованиях.
Материал любезно предоставлен: Максимом Пешковым (Патологоанатомическое бюро,
г. Таганрог, 2008). По материалу был сделан доклад на съезде патологов по вопросам диагностики рака молочной железы в Москве, 2008.
ПЕРЕЙТИ
 
PatologoanatomДата: Понедельник, 2010-03-01, 8:45 PM | Сообщение # 19
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 750
Репутация: 11
Статус: Offline
Vladpatholog и Mаксим, огромное спасибо за полезный материал.
Для меня было интересным узнать о применении микроволновой печи не только в ИГХ для демаскировки антигенных эпитопов, но и использованием в классической гистохимии.
 
MaximДата: Суббота, 2010-04-24, 11:42 PM | Сообщение # 20
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 503
Репутация: 25
Статус: Offline
Для укорочения времени высокотемературной демаскировки, на мой взгляд, должна хорошо подойти пара: индукционная электрическая плитка + скороварка. Такая плитка стоит не дороже 2000 р в обычном магазине бытовой техники. ,Время нагрева посуды на ней вдвое меньше, чем посредством любого электрического или газового прибора (есть функция температурного контроля и режим "варки супа"), а время демаскировки в скороварке под давлением достаточно 4 мин с момента "закипания" закртытой скороварки. Однако, скороварка может быть пригодной не для всех антигенов.
Во всяком случае скороварка у меня уже есть, а вопрос приобретения такой плитки в лабораторию сейчас решается. Время же остывания стекол после демаскировки никак не сократить - постепенное остывание критично.
 
RomanДата: Воскресенье, 2010-04-25, 9:20 PM | Сообщение # 21
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
До какой температуры должно быть постепенное остывание стекол, а когда его можно форсировать перемещением, допустим, в буфер комнатной температуры?

От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
MaximДата: Воскресенье, 2010-04-25, 9:43 PM | Сообщение # 22
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 503
Репутация: 25
Статус: Offline
Обычно по окончании "кипячения стекол" пластиковые сосуды со стеклами накрывают крышками плотно, чтобы раствор не испарялся и выставляют из бани (или другого прибора) на стол для остывания примерно градусов до 35-40оС. Обычно сосуд с 24 стеклами остывает 20-30 минут. Потом стекла переносят в промывочный буфер комнатоной температуры. Эта разница уже не существена для срезов.
Приливать охлажденный буфер в сосуд со стеклами или дистиллированную воду не стоит.
 
БеляшДата: Суббота, 2011-01-22, 11:55 AM | Сообщение # 23
Лейтенант
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 9
Репутация: 0
Статус: Offline
Коллеги, а кто-нибудь использует энзиматическую демаскировку? Приобрели мы антитела для идентификации макрофагов, а в спецификации написано: requires trypsin or pronase pre-treatment. Решили проводить демаскировку трипсином, согласно рекомендациям: инкубация срезов при 37 градусах с 0,05% раствором трипсина + хлорид кальция, в течение 10-20 минут. Итог: жуткая морфология + фоновое окрашивание. Опытным путем дошла до такого решения: 5 минут инкубация с трипсином при 37, далее срезы помещаю в дистил воду, предварительно охлажденную до 4 градусов с целью остановить реакцию. Ткань выглядит приличнее, фоновая окраска снижается, но все же срезы далеки от идеала. Если кто-нибудь использовал трипсиновую демаскировку, поделитесь опытом, пожалуйста!
 
lab_nskДата: Воскресенье, 2011-01-23, 8:45 AM | Сообщение # 24
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Репутация: 2
Статус: Offline
Беляш, а какое именно антитело используете?
 
MaximДата: Воскресенье, 2011-01-23, 9:36 AM | Сообщение # 25
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 503
Репутация: 25
Статус: Offline
Некоторые антитела требуют демаскировки ферментами и об этом написано во вкладышах. Обычно демаскировка ферментами выполняется при комнатной температуре за 5-15 мин при температуре 37оС. Необходимое время подбирается опытным путем. Промывка в 2-3 сменах промывочного буфера по 3 мин каждая. Морфология повреждается в том случае, если фиксация была недостаточной. Вторая возможность нарушения морфологии - нерпавильное высушивание срезов перед депарафинированием.
 
БеляшДата: Воскресенье, 2011-01-23, 12:14 PM | Сообщение # 26
Лейтенант
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 9
Репутация: 0
Статус: Offline
Quote (lab_nsk)
Беляш, а какое именно антитело используете?

используем CD172a (SIRP) клон ОХ41 производства Millipore. Там в спецификации рекомендована демаскировка трипсином или проназой. Трипсин мы выбрали наугад.

Maxim, спасибо за информацию. Что касается фиксации материала: срезы я готовила с одного и того же блока, а ткань выглядит по-разному в зависимости от времени инкубации с трипсином. По поводу второй возможности: а как правильно сушить срезы? Использовать инкубацию при комнатной температуре, честно говоря, даже в голову не пришло. Думала, что оптимальная температура для работы фермента именно 37 градусов? А промываем мы хорошо:)

 
MaximДата: Воскресенье, 2011-01-23, 3:01 PM | Сообщение # 27
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 503
Репутация: 25
Статус: Offline
Действительно, я не совсем точно написал об условиях демаскировки фрементами (исправляюсь).
Quote (Maxim)
Обычно демаскировка ферментами выполняется при комнатной температуре за 5-15 мин при температуре 37оС
Я имел в виду, что при комнатной температуре достаточным является промежуток от 5 до 15 мин. Если результаты неудовлетворительные, то пробуйте 5 мин при 37оС. Ферменты имеют свойство разрывать перекрестные связи, образованные формалином. Действие ферментов неспецифично, поэтому они гидролизуют все, что доступно. Разумеется, этот процесс при 37оС идет веселее, а Вам остается меньше морфологии. Вспомните закон Вант-Гоффа: при изменении температуры на каждые 10оС скорость химических реакций изменяется в 2-4 раза. Таким образом, Вы должны иметь схожую картину при работе одного фермента при 25оС 15 мин и его же при 37оС 5 мин. Ферменты - белки, и антитела белки. Все работает и при 25оС, только медленнее. Если фиксация была в 10% нейтральном забуфренном фосфатами формалине менее 24 часов при комнатной температуре в кусочке толщиной не более 3мм, то вероятность получения отвратительной морфологии очень велика. Высушивание срезов: Комнатная температура или термостат 37оС до утра. Перед депарафинированием снова сушить в термостате 30-60 мин при 60оС. Срезы ВСЕГДА сушить вертикально. О нагревательной пластинке и горизонтальной сушке срезов для ИГХ лучше забыть. Все промывочные этапы в ИГХ выполняются только промывочным буфером. Никогда дистиллированной водой. Сообщите, пожалуйста об отрицательных и полжительных эффектах, когда попробуете.
 
niksavelovДата: Понедельник, 2011-01-24, 9:24 AM | Сообщение # 28
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Quote (Maxim)
Все промывочные этапы в ИГХ выполняются только промывочным буфером. Никогда дистиллированной водой.

С этим утверждением категорически не согласен. Всё зависит от того что и на каком этапе промывать. Уже много лет я использую для промывки на некоторых этапах дистиллированную воду с 0.05% Tween20. Но есть нюансы:

1. Из работ Thomas Boenisch начала века я почерпнул идею, которой следую до сих пор: Никаких буферов до этапа первых антител! Он объясняет это тем, что любой буфер, по определению, изменяет конформацию антигенов, и часто совершенно не оптимальным образом. Т.к. большинство эпитопов с которыми приходится работать не линейные. а конформационные, то все этапы отмывки раствора для демаскировки и перекиси я провожу в дистилляте с твином.

2. Rodney T. Miller в своей знаменитой лекции 2001 года рекомендовал так же отмывку первых антител и системы делекции проводить в дистилляте с твином. Я так делал пока в лаборатории не появился стейнер LabVision, т.е. пока работали вручную и лаборант чётко соблюдал время и кратность отмывки. Наш иммуностейнер не очень чётко соблюдает время отмывки - для него время отмывки это "разменная монета" при оптимизации протокола окрашивания в целом. К тому же объём жидкости на стекле в стейнере не тот, что был у меня в контейнерах для отмывки. Поэтому сейчас я отмываю первые и вторые антитела по схеме: буфер-"вода"-"вода". И только полимер я мою двумя сменами буфера. Почему - сам не знаю. Как-то так исторически сложилось.

Пользуясь этой схемой, а так же использую полимерные системы детекции и титруя каждый лот антител я вообще забыл что такое фоновое окрашивание. единственный его сорт, который встречается пока ещё регулярно - это MAG (Mouse ascites Golgi).


Никита Савёлов
 
RomanДата: Понедельник, 2011-01-24, 3:27 PM | Сообщение # 29
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Уважаемый niksavelov, поделитесь тогда, пожалуйста, подробнее схемой отмывки вручную дист водой с твином (а можно без твина?): время кратность и объем, может еще что-то. А промывать можно все этапы, я так понял? И как часто менять батарею промывки

От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
niksavelovДата: Понедельник, 2011-01-24, 4:17 PM | Сообщение # 30
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Без твина никак. Особенно в иммуностейнере открытого типа. У меня твин входит в состав всех реагентов т.к. иначе реагенты плохо растекаются по стеклу и покрывают довольно маленькую область. А с твином они распластываются на максимально возможную площадь, и 200 мкл. хватает что бы закрыть 2/3 поверхности стекла.

Для начала необходимы некоторые вводные пояснения. У нас два протокола - с демаскировкой в буфере с рН=6.0 и 9.0. Тот что 6.0 - это Dako'вский S1699, а тот что 9.1 - это 3-в-1. Его готовим сами по прописи:

TE с Triton X-100, pH=9.1 (x1)

Tris Base 1.815 g 10 mM
EDTA Na2 0.555 g 1 mM
Triton X-100 7.5 ml 0.5 %
DI H2O up to 1500 ml.

При использовании протокола с рН=9.1 срезы из РТ-модуля (по-сути водяная баня с термоконтролером и вентилятором для охлаждения), в котором они охлаждаются после демаскировки до +65С, сразу переносятся в дистиллированную воду с 0.05% Tween20 (далее, для кратости, буду использовать просто термин "вода") на 10 мин при комнатной температуре. Этот перепад температур никак не влияет на адгезию ткани к поли-лизиновому стеклу (срезы ни разу не слетали). Объём "воды" в ванне - 1500мл. В этом объёме отмывается не более 72 стёкол. Я сейчас отмываю вообще лишь 36 стёкол в одной смене (одна загрузка стейнера = один рабочий день). Не по каким-то идеологическим причинам, а просто для воспитания в лаборанте культуры лабораторной работы - чтоб на неделю не оставляли. После этого срезы загружаются в стейнер, ещё раз смачиваются "водой" из бутылки с носиком, затем запускается протокол. Протокол идет по общей схеме: Вода--3% водный р-р перекиси водорода 15 мин.--вода--сыворотка животного из которого получены вторые антитела 5 мин.--вода--первые антитела 20-30 мин.--буфер--вода--вода--вторые антитела 10 мин.--буфер-вода--вода--полимер с пероксидазой--буфер--буфер--DAB 5 мин.--буфер--DAB 5 мин.--вода--медный купорос 5 мин.--вода и далее по списку (докраска ядер и т.д.).

При использовании Dako'вского буфера для демаскировки с рН=6.0 протокол несколько отличается, но не принципиально в отношении использования "воды".


Никита Савёлов
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Демаскировка антигенов
Страница 2 из 3«123»
Поиск: