Демаскировка антигенов - Страница 3 - Форум
 
Демаскировка антигенов - Страница 3 - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2016-12-09, 10:41 AM

Страница 3 из 3«123
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Демаскировка антигенов
Демаскировка антигенов
PatologoanatomДата: Вторник, 2006-10-03, 2:33 AM | Сообщение # 1
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 743
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (Vladpatholog)
Ну вот и на моей улице праздник - бюро приобрело ретривер - Наконец-то срезы не отваливаются от стекол! видимо в микроволновке (даже как-то неудобно говорить о том, что мы ей пользовались до сих пор) не хватало давления.

Уважаемый Vladpatholog,
Термическая обработка гистологических срезов в микроволновой печи с целью демаскировки антигена - не такая уж и плохая методика.
Иммуногистохимия, как и любая изысканная кухня требует творческого подхода. Следует учитывать тип буферного раствора, его pH, искомый антигенный эпитоп. Большинство компаний производителей антител снабжает специалистов информацией о рекомендуемом типе обработки ткани (энзиматическом, тепловом), буферном растворе с учетом типа фиксатора и тканевой обработки. В разных случаях требуются разные методы. Например для ИГХ окрашивания с одним антителом лучше использовать обработку в водяной бане, с другим микроволновка, а с другими рисоварка или пароварка. Звучит забавно, но это так. Кроме того каждый раз рекомендуется титровать антитела.
Для избежания отскакивания материала от стекол требуется применение положительно заряженых предметных стекол (с меткой x в нижних углах) или обработанных полилизином.
Лучше использовать стандартизованные протоколы, но каждая лаборатория имеет свои секретные рецепты.


Сообщение отредактировал Patologoanatom - Вторник, 2006-10-03, 2:36 AM
 
RomanДата: Понедельник, 2011-01-24, 11:32 PM | Сообщение # 31
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Спасибо за ответ, но остались вопросы при ручной работе
1. все таки вода не полностью заменяет буфер? или можно только с водой на всех этапах?
2. отмывка по 1 мин в каждой смене буфера и воды?
3. и вопрос дилетанта полимерная система детекции это, например, Envision? или другая?


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
MaximДата: Вторник, 2011-01-25, 0:04 AM | Сообщение # 32
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Roman! 1. Rodney Miller (Propathlab) и Dave Tasha (BioCare), которые предложили этот метод промывки водой с твином - люди, конечно, видные. Однако, за ними мало кто последовал с 2001 года. И не опубликованы количественные оценки - только впечатления. Это настораживает. Я избегаю всякой воды даже после пероксидазного блока. В других рукодствах (Abcam) пишут, что TBST наоборот защищает от фонового окрашивания. У Dabbs 2010 тоже что-то про воду ничего не сказано, да и Boenisch в даковских брошюрах (4-5 изд) воду не рекламирует и т.д. 2. Я вручную промываю TBST из пипетки 3-4 раза по 3 мл между всем этапами ИГХ. Никакого фона или что-то в этом роде. Часто следы диффузии антигена заметны от неадекватной фиксации. Наши онкологи любят нам доставлять отвратно фиксированный материал (ничего не можем поделать пока). 3. Полимерные системы: EnVision, EnVision+, Dako dual link, FLEX, Ultra Vision, Novolink, Histofine, Biogenex, DBS, и другие. производители ВСЕГДА пишут о типе системы и в рекламме и во вкладышах.
 
niksavelovДата: Вторник, 2011-01-25, 0:36 AM | Сообщение # 33
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
1. Когда я работал вручную, то кажется использовал буфер только при отмывке полимера, меченного пероксидазой. Т.е. перед DAB. Помню, что при окраске до 500 стёкол в неделю (в одной комнате работало тогда две группы - по эпителиальным опухолям и гематологи) уходило лишь 5-6 л. буфера! Т.е. примерно 10 мл. на стекло. Тогда отмывка происходила в сосудах Хелендахеля. В один сосуд помещалось 15 стёкол и примерно 70 мл. буфера. 70 мл./15 стёкол ~ 5мл. Отмывка была 2 раза по 5 мин. Вроде всё сходится. Всё остальное отмывалось в дистилляте с твином. Но это всё было 2.5 года назад, да ещё и в другом учреждении. Поэтому некоторые детали я мог уже подзабыть.

2. Нет, не по одной минуте. Вручную лучше делать по 5 мин. два раза после каждой инкубации чего-либо. В нашем стейнере всё нескольк сложнее. Реально получается минуты по три-четыре, поэтому и три отмывки стоит. Я пробовал программировать стейнер делать отмывку по 5 мин., но если это плохо вписывается в общую схему протокола (например, при разном времени инкубации первых антител на разных стёклах), то стейнер сокращает время отмывки т.к. в нем запрограммирован приоритет времени инкубации. Поэтому и пришлось для надёжности делать три смены (дополнительно поставить буфер), в чём при ручном окрашивании нет необходимости.

3. Envision - это самая низкочувствительная полимерная система детекции существующая на рынке в настоящее время. Даже Envision FLEX+ не сильно лучше! Мы пользуемся UltraVision Quanto от Thermo Scientific. Хотя я ради интереса перепробовал почти все полимеры, которые можно было купить в России, а так же некоторые, которые здесь никогда не продавались (ADVANCE, например от Dako).

Добавлено (2011-01-25, 0:36 Am)
---------------------------------------------
Ну вот, как всегда опоздал с ответом. Пока писал Maxim уже всё прокомментировал! На этом месте хотелось бы сделать пару ремарок:

Quote (Maxim)
Biogenex, DBS

- это название компаний, а не систем детекции. Но полимерные системы есть и у этих производителей. Много лет я предпочитал именно полимерники от BioGenex.

Quote (Maxim)
да и Boenisch в даковских брошюрах (4-5 изд) воду не рекламирует

- Во первых Boenisch уже Retired consultant! Его идеология как методиста очень сильно расходится с идеологией Dako, что очень хорошо видно из его статей в AIMM. Кроме того, он в руководствах писал лишь первые три общие главы, а отмывка в пятом, например, издании руководства разбирается подробно в 16 главе совершенно другим человеком.


Никита Савёлов
 
RomanДата: Вторник, 2011-01-25, 7:32 PM | Сообщение # 34
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Уважаемые Maxim, и niksavelov, спасибо за обстоятельные ответы. вот так и обрастаешь знаниями. извините за дотошность промывать вручную, если не из пипетки,а в бюксах по пять минут, то все это время полоскать или можно оставить их без движения? Водой все таки попробую для экономии буфера, все у нас приходиться экономить. И систему детекции надо менять.

От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
MaximДата: Вторник, 2011-01-25, 8:43 PM | Сообщение # 35
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Roman! Промывка в бюксе (он же стакан для окраски) - медленные круговые движения стеклом 5-8 движений и затем перенести в другой сткан. Стекла оставлять так, чтобы срезы не касались других стекол. По 2 стекла (back-to-back) не переносить, только по одному. После второго стакана можно переставить и в третий (если будете в воде промывать). Первый стакан вылить, остальные передвинуть влево - последний свежий после каждого этапа окраски. Достаточно подержать их в свежей воде с твином не менее 2-3 минут. Вынимая также можно сделать 2-3 не быстрых макащих движения. Это достаточно качественная промывка. Вы сэкономите уйму времени, если возьмете полистироловую планшетку для стекол (кажется Биовитрум продает такие по 80р) и разрежете на 2 части по 10 стекол и поставите ее во влажную камеру. Стекла будет удобно брать руками и ставить назад. После промывки эту мини-планшетку поставьте примерно под 45оС и промокните под срезами скапливающиеся капли, верните в горизонтальное состояние и нанесите реагенты (блок, а/т, систему, ДАБ). Поставьте обратно в камеру. Быстрее, чем возиться с каждым стеклом и раскладывать на стеклянные салазки? Планшетку можно использовать для этапов от пероксидазного блока до ДАБ. Все остальные этапы спокойно выполняются в обычных стойках для окаски. Кстати, о мытье. Посуду для ИГХ нельзя мыть хлорсодержащими моющими средствами, поскольку остатки хлора инактивируют любые белки. Или промывайте основательно проточной и потом дистиллированной водой.
 
AnitraДата: Среда, 2011-07-20, 0:10 AM | Сообщение # 36
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Репутация: 2
Статус: Offline
Добавлю про системы детекции -
сейчас на рынке есть не только полимерные, но еще дальше шагнувшие системы детекции.

Если не ошибаюсь там используются так называемые линкеры (long-arm linkers).
Представляют из себя небольшую линейную молекулу с HRP на конце.
В отличии от полимерной системы детекции значительно более чувствительны из-за размера молекулы (в справнении с полимером как у Даковской системы)
плюс картинка получается "в фокусе" - гораздо более резвкая, опять же, из-за того что сигнал не размазывается, а более локальный.

Да и стоят они дешевле полимерных (что кстати удивительно, но приятно!)


Червяк длинный, а жизнь короткая
 
niksavelovДата: Среда, 2011-07-20, 10:44 AM | Сообщение # 37
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Quote (Anitra)
В отличии от полимерной системы детекции значительно более чувствительны из-за размера молекулы (в справнении с полимером как у Даковской системы)

А есть ли какие-либо научные публикации на эту тему в реферируемых журналах? Или информация почерпнута только из Абкамовских и Спринговских рекламных брошюрок?

Кроме того, сравнивать любые современные полимерные системы детекции или системы с long-arm linkers с Доковскими декстрановыми полимерами вообще не очень честно что ли. У Дако были первые полимерные системы детекции, появившиеся на рынке (90-е годы ХХ в.). Тогда это была революция т.к. среднемономолекулярные декстраны не реагируют ни с какими компонентами человеческих тканей, т.е. сами по себе не дают фонового окрашивания. EnVision - одноступенчатая система, т.е. была экономия времени. Но Даковцам не повезло - декстраны сильно гидратируются, что значительно увеличивает размер молекулярного комплекса. Поэтому EnVision и её дочки (Advance и FLEX) плохо проникают через билипидные слои клеточной и ядерной мембран. Особенно это становится критичным при исследовании ядерных антигенов. Т.е. результат сравнения любых современных полимерных или long-arm linkers-содержащих систем детекции с декстрановыми заранее известен - декстановые (за исключением EnVision FLEX+) менее чувствительны (см., например, http://www.nordiqc.org/seminars/Krakow-10/Krakow-SN-2010.pdf - таблица на стр. 6). При разработке своих полимерных систем конкуренты Дако этот факт учитывали. Поэтому декстраны больше никто в полимерных системах не использует. Все остальные полимерные системы детекции компактнее, а следовательно чувствительнее чем EnVision. Поэтому сравнивать Абкамовский EXPOSE или Спринговский REVEAL надо с какой-нибудь полимерной системой детекции с мелким полимером (например, с UltraVision Quanto от Thermo Fisher Scientific).


Никита Савёлов
 
AnitraДата: Среда, 2011-07-20, 11:53 PM | Сообщение # 38
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Репутация: 2
Статус: Offline
Quote (niksavelov)
А есть ли какие-либо научные публикации на эту тему в реферируемых журналах? Или информация почерпнута только из Абкамовских и Спринговских рекламных брошюрок?


Информация почерпнута из рекомендаций коллег и последовавшего за ними личного опыта. Но думаю я задамся целью и поищу статьи.
Кроме того, у меня есть подозрения что Ventana использует именно эти системы детекции в своих приборах (думаю что это Spring). А они ребята привередливые...

Quote (niksavelov)
Кроме того, сравнивать любые современные полимерные системы детекции или системы с long-arm linkers с Доковскими декстрановыми полимерами вообще не очень честно

я привожу такое сравнение только исходя из того, что Дако в России очень долго был моноволистом на рынке, и большинство сидят именно на их системах детекции. Но прогресс не стоит на месте и никого не щадит. А вот информационная коммуникация страдает. Маловато меропиятий где можно безболезненно почерпнуть новинки и перенять опыт. Вот и используют то к чему привыкли...


Червяк длинный, а жизнь короткая
 
niksavelovДата: Четверг, 2011-07-21, 9:41 AM | Сообщение # 39
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Да, совсем забыл про Вентану. У них то же long-arm linkers в ultra View используется. Возможно и Спринговская, не знаю. С ultra View есть опыт работы. Какой-то уж очень высокой чувствительностью эта система не обладает. Через пару недель планирую сравнить её в прямых тестах с UltraVision Quanto. Результатом поделюсь на форуме обязательно. При всей привередливости Вентаны ничего нового в их подходах к этапам иммунного окрашивания не наблюдается. Суммарная чувствительность протоколов у них складывается из демаскировки в растворе с EDTA (СС1), подогреве стёкол при инкубации антител и системы детекции, и достаточно современной системы детекции. Все те же принципы реализованы, например, в автостейнерах Bond (Лейка), которые есть на российском рынке.

Никита Савёлов
 
AnitraДата: Четверг, 2011-07-21, 1:56 PM | Сообщение # 40
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Репутация: 2
Статус: Offline
niksavelov, ну не скажите... в вентане есть несколько ноу-хау - жидкое покровное стекло, воздушный вортекс
Подогрев каждого стекла индивидуален, в отличии от Бонда, где разбивка идет по планшетам, что позволяет запускать одновременно всего 3 протокола, а Вентане при желании можно и 30 запустить.
+ у Бонда эта дикая система кавертилей - нахлобочки на стекла предотвращающие высыхание - каждую можно использовать строго 25 раз, они царапаются, ломаются, к ним прилепают срезы и трескаются слайды. У нас это все не будет работать.
Я очень скептически к Бонду отношусь.
Кстати, Бонд это единственный приближенный аналог вентаны. Больше на рынке нет пока приборов которые делают все от депарафинизации до подкраски.
Вот когда X-Matrix выйдет, тогда будет о чем поговорить. Но индусы его родить не могут уже очень давно. Остальные аппараты - что Дако, что Термо, что BioCare - простые капалки...

Кстати демаскировка в Вентане делается не только СС1 (это кстати трис-буфер). У них есть еще СС2, есть ферментная демаскировка, можно их комбинировать... Тот же пан-кератин получается очень круто если делать СС1 + Протеаза. Просто заглядение. А если не комбинировать - есть неспецифика. Ручами обычно в лабораториях не очень любят с ферментами возиться.

Вы планируете вентановскую или спринговскую систему с Ультравижн сравнивать? Разве вентановскую систему можно достать отдельно от вентаны?
результаты были бы очень интересны. Жду с нетерпением.


Червяк длинный, а жизнь короткая
 
niksavelovДата: Четверг, 2011-07-21, 3:59 PM | Сообщение # 41
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Жидкое покровное стекло, воздушный вортекс - эти технологии не имеют прямого отношения к самому иммунному окрашиванию. Эти ноу-хау имеют отношение исключительно к функционированию самой железяки (автостейнера), которая у Вентаны скофигурирована далеко не лучшим образом. Для обсуждения железа предлагаю открыть отдельную ветку форума. Я, например, к Бонду менее скептически отношусь. Да и простые капалки сейчас довольно надёжны и в плане работы, и в плане результата.

Но мы не об этом, а об окрашивании. Много в Вентане протоколов для ИГХ, в которых используется CC2? Они почти все, за редким исключением, используют СС1. А СС1 - это Tris/EDTA (то, что в каталоге Вентаны написано, что СС1 is a tris-based buffer ещё не говорит, что в нём нет EDTA). Редкие исключения о которых я говорил касаются CC1+протеза. Протеаза по большому счёту в современной ИГХ не очень нужна. Мы вообще обходимся без протеазы. Просто подбираем клоны антител, которые дают хорошие результаты при демаскировке в буферах с EDTA или с цитратом.

С UltraVision Quanto собираюсь сравнивать Вентановскую систему. Достать её отдельно от Вентаны я не пытал. Нам её поставляют к Вентановскому автостейнеру.


Никита Савёлов
 
ZayokДата: Четверг, 2014-12-18, 10:26 AM | Сообщение # 42
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 1
Репутация: 0
Статус: Offline
Прошу помощи. нам в лабораторию поступила новая система визуализации DAKO FLEX En Vision.  в каком количестве добавлять EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) на 1 л дистиллированной воды? EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x)  50 мл раствора на 950 мл дистиллированной воды?
буду очень благодарна.
 
MaximДата: Четверг, 2014-12-18, 9:33 PM | Сообщение # 43
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Zayok, с концентратами все очень просто. 50х озанчает, что вы должны 1 часть концентрата развести в 49 частях воды. Или 1 мл концентрата + 49 мл воды. Литр еще проще: 1000 мл / 50 = 100/5=20. Т.е. 20 мл концентрата 50х + 980 мл деионизированной воды (или еще говорят, долить до литра).
20х озаначет: 1 часть концентрата + 19 частей воды. На литр: 1000/20=100/2=50 мл концентрата 20х + 950 мл воды.
10х: - 1 часть концентрата + 9 частей воды.
Часть может быть млиллитром, литром  и т.д.
Для демаскировки в зеленых пластиковых емкостях достаточно 150мл демаскирующего раствора.
Тогда потребуется 3 мл концентрата 50х + 147 мл воды, в случае концентрата 10х: 15 мл концентрата + 135 мл воды.
При окраске вручную на промывку каждого стелка досаточно потратить 3 мл промывочного раствора. Я трачу для послного цикла окраски ИГХ 20 стекол 750 мл разведенного промывочного буфера (сюда входит промывка после демаскировки, все этапы ИГХ и подсинивание гематоксилина).
Вся трудность в отмеривании нужного количества жидкости. Обязательно используйте калиброванную по ГОСТ посуду. Как правило, это стеклянная посуда. Мне не попадалась пластиковая тара, калиброванная по ГОСТ.
Так как все калибруется по деионизированной воде, а потом меряется по соотвествующим штрихам на шкале предлагаю все упросить для целей ИГХ. Плотность концентратов условно можно считать равной 1, так же как и воды. То, есть, будет гораздо точнее, если вы будете мерять количество воды не по штрихам (особенно неудобно это делать в высоких мерных цилиндрах), а просто взвешивая соответстующее количество на электронных лабораторных (калиброванных) весах с точностью до 2 знака после запятой. Такие весы не дороги, но очень удобны в рутинной работе. Вы потратите несколько секунд на взвешивание, количество отмеряете точнее, чем по штрихам, а тара может быть той, которая удобна или необходима вам, без всяких рисок и калибровок. Я давно отказался от мерных стаканов и цилиндров.
Система FLEX работает вполне хорошо. Каждый раз внимательно читайте надписи о концентрации на флаконах. У Дако есть и готовые растворы для демаскировки.
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Демаскировка антигенов
Страница 3 из 3«123
Поиск: