Вы вошли как Гость
Текущая дата: Суббота, 2024-04-20, 3:49 PM
|
Фиксаторы
|
|
| Roman | Дата: Суббота, 2008-12-13, 10:27 PM | Сообщение # 1 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги, вопрос покажется странным и все же.
Материал, фиксированный в кислом формалине, совсем безнадежен для иммуногистохимии? И можно ли его спасти, поместив например в нейтральный или забуференный формалин?
Спасибо за ответы.
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Суббота, 2008-12-13, 11:49 PM | Сообщение # 2 |
 ___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Оптимально, конечно, использовать забуференный раствор формальдегида и время фиксации до 48 часов. Дополнительная фиксация в других растворах не даст улучшения антигенных свойств. Лучше попробовать применять разные техники демаскировки, с различными растворами (например, EDTA+Tris, Citrate) и методами (тепловая обработка в микроволновке или пароварке). Для проверки качества антигенных свойств ткани порекомендовал бы сначала окраску с виментином (vimentin V9).
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Воскресенье, 2008-12-14, 11:36 AM | Сообщение # 3 |
 Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Подавляющее количество материала, поступающего в нашу лабораторию были проведены через простой формалин, парафин неизвестного качества и хорошо если не обошлось без подкрашивания эозином. И ничего - чаще все хорошо получается, отработайте у себя демаскировку , используйте полимерные системы детекции и все будет хорошо. А переносить материал в забуференный формалин после полной его фиксации в обычном формалине - нет смысла. Другое дело если вам материал принесли в "неправильном" формалине из соседнего здания, тогда вполне можно и переместить.
С уважением.
|
| |
| |
| Roman | Дата: Воскресенье, 2008-12-14, 8:08 PM | Сообщение # 4 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Спасибо за советы
Возникает вопрос о следующем этапе - демаскировке. Лучший вариант дескамировки (при "неправильном" фиксаторе) определяется опытным путем или есть предпочтительные варианты a priori?
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Понедельник, 2008-12-15, 9:22 AM | Сообщение # 5 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Уважаемый Roman,
Чтобы избежать затраты реагентов и времени, лучше использовать вид демаскировки и оптимальное разведение, описанные в описании к первичному антителу (например, для поиска некоторых антигенных детерминант лучше использовать не тепловую, а энзиматическую обработку).
Если плохо сработает метод из описания, определять поиском методологии в авторитетной литературе и опытным путем.
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Понедельник, 2008-12-15, 2:07 PM | Сообщение # 6 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| присоединяюсь к Patologoanatom, внимательно читайте инструкции к антителам.
|
| |
| |
| Roman | Дата: Понедельник, 2008-12-15, 3:41 PM | Сообщение # 7 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Понял, спасибо
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Суббота, 2010-02-27, 2:15 PM | Сообщение # 8 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги, в ряде отечественных руководств, да и зарубежные коллеги предлагают проводить фиксацию тканей в целом и трепанобиоптатов в частности в кислом цинк-формалине или цинк-формалине. Такая фиксация позволяет и ИГХ затем выполнять и в отличие от других методов в отношении трепанобиоптатов наиболее предпочтительна (еще лучше жидкость Ценкера - на сулему достать очень сложно). Попытался приготовить этот самый кислый цинк-формалин, но вот проблема - в результате хлорид цинка выпал в виде осадка на дно емкости. Это вообще нормально? Или что-то не так пошло? В состав входят: формальдегид+дист.вода+ледяная укс.кислота+хлорид цинка. Какую роль здесь выполняет хлорид цинка - может он сделал свое дело и его можно убрать (т.е. слить то, что получилось сверху) или я чего-то не тосделал.
Работал по методике:
Цинк формалин:
Хлорид цинка500 г
Формалин (40% ный водный раствор формальдегида)3 л
Ледяная уксусная кислота19 мл
Дистиллированная вода 20л
Все делал в пересчете на 1 литр.
При приготовлении кислого цинк-формалина суть та же была, тоолько меньше хлорида цинка и больше уксусной кислоты. (ссылка на статью см. выше)
Я вот еще подумал - может в осадок выпал параформальдегид, попробовал эту болтанку нагреть в водяной бане - осадок не пропал, если параформальдегид вроде должен был раствориться.
В общем в раздумьях.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2010-03-01, 9:51 PM | Сообщение # 9 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Vladpatholog!
Уксусная кислота в составе фиксаторов действительно подчеркивает ядерную деталировку.
Сулему в любом виде следует избегать - слишком дорого рисковать здоровьем сорудников и благополучием окружающей среды. Не настолько дихлорид ртути важен для диагноза.
Но почему не устравивает фиксация обычным 10% нейтральным забуференным формалином? Все антитела, одобренные FDA требуют фиксации именно в нем. Время - не меньше 24 часов для образования устойчивых перекрестных связей, позволяющих самым нежным тканям выдержать многочисленные мощные физические и химические стрессы при проводке и последующих манипуляциях. Любая недофиксация в формалине будет закончена отнимающими воду спиртами в начале проводки, и закончится смесью двух разных способов фиксации, что может навредить многим ИГХ-тестам, потому что ни один из этих двух фиксаторов не среагирует в полной мере. При приготовлении этого фиксатора не должно быть никакого осадка.
Попробуйте последовательность: вода, хлористый цинк (можно подогреть примерно до 45-50оС, пока не получится прозрачный раствор, потом прилить уксусную кислоту и формалин). Все делать под вытяжкой, в перчатках.
У вас получилось в итоге: 15% формалин, 2% хлористый цинк и 0.01% уксусная кислота (это приблизительно). Если вместо такой дорогой и сложной смеси Вы прибавите к 10% незабуференному водному формалину 5% ледяной уксусной кислоты, то получите ожидаемую красивую и четкую деталировку ядер на Г-Э.
Однако, если трепаны, фиксированные в 10% нейтральном забуференном формалине (не меньше 24 часов) декальцинировать в 10% динатриевой ЭДТА, забуфренной NaOH до рН 7.0 (или 14% тетранатриевой ЭДТА, забуференной уксусной кислотой до рН7.0) до утра, и потом промыть в нескольких (4-5) сменах физраствора (30 минут всего) и затем провести через изопропанол-парафин, как описано в цитируемой книге (или изопропанол-минеральное масло), то Вы сможете получить не только четкю и красивую картинку трепана на Г-Э и азур-эозине, но и качественные результаты ИГХ.
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Вторник, 2010-03-02, 1:49 PM | Сообщение # 10 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Quote Уксусная кислота в составе фиксаторов действительно подчеркивает ядерную деталировку
собственно в том и суть. Вопрос дифференцировки по характеру ядерных элементов один из наиболее значимых в диагностике по трепанобиопсиям. Вот вы мне и подсказали к чему там уксусная кислота. А в целом нашел довольно много статей посвященных достоинствам кислого цинк-формалина в трепанобиопсиях (для ИГХ тоже годится). Вообще много вопросов по самой методике приготовления этого формалина.
Например - пришел на вырезку развести формалин с удивлением обнаружил, что во фляге с 40% формалином на дне приличный белый осадок. Нашел в сопроводительных документах, что возможно оседание параформальдегида, растворение которого можно достигнуть путем прогревания раствора. Вот вопрос - а то, что сверху (прозрачное) это что
- 40% формалин, или это менее концентрированный раствор и для получения 40% нужно именно взбултыхать это все а потом прогреть до растворения (сомневаюсь что там что-то раствориться - уже грел в смеси о чем писал выше).
Теперь вопрос по поводу приготовления раствора по вами рекомендованному методу.
1. Подскажите пожалуйста - сколько конкретно забуференного 10%-го раствора формалина нужно смешать с концентрированной (ледяной) уксусной кислотой для получения заветного раствора.
2. А какую роль выполняет в цинк-формалине этот самый цинк?
Очень рад вашим обстоятельным советам.
С уважением,
Владимир.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2010-03-02, 7:20 PM | Сообщение # 11 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Владимир!
Формальдегид - это наше спасение и наказание и еще долго мы будем ждать его замены.
Осадок - это полимеризованный формальдегид, выпадает при охлаждении концентрата, а жидкость над ним - вода. поэтому хранить его нужно при комнатной температуре и не допускать выпадения осадка. Если осадок есть, то перед приготовлением раствора осадок нужно очень сильно разболтать, чтобы получилась взвесь и в приготавливаемом растворе потом она растворится, если готовый раствор подогреть примерно до 60оС (несколько часов или ночью). Правда, где оставить на ночь фиксатор в канистре? У нас термостаты стоят в лаборатории - это единственная комната кроме вырезки, и тогда прийдется несладко всем, если в помещении будут пары нагретого раствора. Уксуснокислый формалин:
900 мл дистиллированная вода
100 мл 37% формальдегид
50 мл ледяная уксусная кислота.
Хранить в таре из темного стекла.
Рецепт из книги AFIP 1992 (Laboratoty methods in histotechnology). В забуференный раствор не нужно добавлять уксусную кислоту, так как конечная концентрация уксусной кислоты будет меньше, поскольку часть ее будет связана солями буферного раствора. В результате смысл забуферивания сведется к нулю, ведь такое большое количество кислоты уничтожит буферную способность раствора. Соли переходных металлов, таких как цинк, вызывают осаждение белков и образуют с ними нерастворимые соединения. Есть очень много литературы по этому вопросу. Я пришлю его Вам в отдельном письме. И вот еще пропись цинк-формалина из книги Kiernan, J.A., Histological & Histochemical Methods, Ed. 3, Butterworth Heinemann, Oxford, UK.
37% формалин 100 мл
Хлоид цинка 1.6 г
Натрия хлорид 4.5 г
Дист. вода 900 мл
Хлористый цинк можно заменить сернокислым цинком или салицилатом цинка. рН можно довести 1M HCl или NaOH (значение не указано, но, кажется до 7.0).
Максим.
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Четверг, 2010-04-15, 11:30 AM | Сообщение # 12 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Вопрос: а выживают ли какие-нибудь антигены после, скажем, годового хранения материала в забуференном формалине? С сидишками-то и прочими поверхностными ясно, что не сохраняются, а вот, скажем, цитокератины или, там, антигены вирусные? У нас очень много скопилось экспериментального материала, сохраненного в таком виде (нельзя было залить), и хорошо бы понять, пропало оно для ИГХ или нет (и, соответственно, заказывать ли антитела).
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2010-04-15, 6:30 PM | Сообщение # 13 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Вопрос пригодности антигенов для окраски после длительного хранения в формалине очень сложный.
В каждом конкретном случае нужно обязятельно пробовать восстановление поврежденных кусочков.
Чтобы длительно не хранить ткани в формалине есть простой выход.
После вырезки, проводки и получения препаратов из основного материала в большинстве случаев становится понятно, представляют они интерес для дальнейшей работы или нет. Если да, то запас уже фиксированный несколько дней в формлалине помещают для хранения в 70% изопропанол (чистый изопропанол также не повредит). Таким образом можно сохранять материал неограниченно долго как для научных, так и для клинических исследований. В некоторых лабораториях так уже делается в рутине. Изопропанол не уплотняет ткани как этанол и после длительного хранения в нем ткани прекрасно режутся после заливки в парафин.
Ведь дейстительно, зачем сохранять материал в формалине, если он губит ИГХ и очень плохо годится для молекуярных тестов? ИГХ и FISH - самые основные и наиболее вероятные последующие тесты в сложных диагностических случаях.
Есть и методы восстановления мумифицированного материала, но вопрос об их последующей пригодности для ИГХ - это предмет для проб в каждом конкретном случае.
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Четверг, 2010-04-15, 8:59 PM | Сообщение # 14 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Quote (Чакона) хорошо бы понять, пропало оно для ИГХ или нет (и, соответственно, заказывать ли антитела).
Можно применить методику контроля с виментином.
Gnzzle W E, Myers R. B, and Oelschlager D K (1995) Prognostic biomarkers in breast cancer factors affecting immunohistochemical evaluation.
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Четверг, 2010-04-15, 10:52 PM | Сообщение # 15 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Maxim) Изопропанол не уплотняет ткани как этанол и после длительного хранения в нем ткани прекрасно режутся после заливки в парафин.
Quote (Patologoanatom) Можно применить методику контроля с виментином.
Gnzzle W E, Myers R. B, and Oelschlager D K (1995) Prognostic biomarkers in breast cancer factors affecting immunohistochemical evaluation. Большое спасибо! Берем на вооружение.:) Кстати, а хранение в 70% этаноле сказывается на ИГХ?
|
| |
| |
|
|
