Вы вошли как Гость
Текущая дата: Суббота, 2024-04-20, 1:02 PM
|
Проблемы с ИГХ-слетают срезы!
|
|
| new | Дата: Четверг, 2006-11-09, 10:00 PM | Сообщение # 1 |
|
Мастер цифровой микроскопии
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 27
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги, помогите пожалуйста. Недавно в нашей лаборатории начали проводить иммуногистохимические исследования, но столкнулись с одной проблемой: около 40% срезов слетает со стекол (используются фирменные стекла “DAKO” покрытые L-полилизином). Для предобработки используется водяная баня (96-98º С) 30 минут. До водяной бани срезы находятся в термостате 60ºС в течении 16 часов. Может кто-нибудь знает как можно решить эту проблему. Заранее спасибо.
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Четверг, 2006-11-09, 11:51 PM | Сообщение # 2 |
 ___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Здравствуйте new!
Вопросы отпадения тканевых срезов мы уже кратко обсуждали здесь.
Чаще всего срезы слетают в растворах ЭДТА c высокими значениями pH, не просушенные при комнатной температуре.
В вашей лаборатории применяется довольно мягкая обработка в водяной бане, попробуйте проверить pH раствора для antigen retrieval.
Для устранения проблемы могу предложить несколько рекомендаций:
при нарезке блоков гистотехнолог может увеличить температуру дистиллированной воды в водяной бане (др. емкости) для расправления срезов на поверхности воды (обычно используется t 42 оС, можно повысить до 50 оС);
попробовать делать более тонкие срезы 3-3,5 микрон, вместо 4-5 микрон (тонкие лучше прилипают к стеклу);
использовать промокательную бумагу для удаления воды, высушивать стекла на
специальной платформе с подогревом до 42 оС, если таковой нет, высушивать стекла в вертикальном положении при комнатной температуре , как минимум 12 часов до помещения в термостат и дальнейшего ИГХ окрашивания;
использовать положительно заряженные стекла, для усиления липкости поверхности обработать их еще и полилизином(купить готовый, развести, стекла подержать 5 мин при комнатной температуре, просушить, в дальнейшем использовать для ИГХ);
обработать ранее обработанные полилизином стекла, полилизином второй раз, просушить, в дальнейшем использовать для ИГХ);
проверить pH буферных растворов, используемых для демаскировки антигена. | Quote (new) | | До водяной бани срезы находятся в термостате 60ºС в течении 16 часов. |
16 часов при 60ºС на мой взгляд, многовато, хватит и 20 мин, перед депарафинизацией, можно потерять антигенные свойства ткани.
Надеюсь, что рекомендации могут быть полезными.
Всего доброго!
Сообщение отредактировал Patologoanatom - Суббота, 2006-11-11, 1:52 AM |
| |
| |
| ильин | Дата: Понедельник, 2007-02-05, 8:30 PM | Сообщение # 3 |
 Рядовой
Группа: Проверенные
Сообщений: 1
Статус: Offline
| Здравствуйте. В нашей лаборатории осваиваем иммуногистохимический метод . В процессе работы возникли проблемы, связанные с тем. что 80% срезов после помещения в Retriver 2100 слетают со стекол.
Мы используем полимизированные стекла DAKО, после нарезки блоков стекла со срезами сразу помещаем в термостат на 2 часа 60 градусов, затем на ночь в термостат 37 градусов, после депарафинизации, помещаем в ретривер в буфер для antigen retriver с pн 6.
Может дело в проводке и качестве парафина?
ПОСОВЕТУЙТЕ , ЧТО ДЕЛАТЬ
ИЛЬИНСКАЯ
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Понедельник, 2007-02-05, 8:45 PM | Сообщение # 4 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Уважаемая коллега,
Проверьте параметры Ретривера, обратитесь с вопросом к специалистам из компаниию
Попробуйте срезы высушивать при комнатной температуре в вертикальном положении, на следующий день в термостате (20 мин, 60 градусов) непосредственно перед депарафинизацией.
Проверьте стекла, попробуйте их дополнительно покрыть полилизином, просушить, в дальнейшем использовать для ИГХ.
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Вторник, 2007-02-06, 1:08 AM | Сообщение # 5 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Еще одна рекомендация.
В поисковике форума IHC World можете поискать по ключевым фразам fall of или tissue detach from slide.
|
| |
| |
| alexmorph | Дата: Вторник, 2007-02-20, 10:08 AM | Сообщение # 6 |
 Генерал-лейтенант
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 9
Статус: Offline
| Нюансы подготовки стекол у нас такие:
1.При расправлении подогрев воды такой, чтобы срезы расправлялись "в натяжку" - на грани расплавления (примерно 45 град)
2.Подсушивание на воздухе 15 минут
3.В термостате при 37 на ночь (12-18 часов)
4.На следующий день 30 минут при 60 град
5.Остудить
6.Обрабатываем - демаскировка в водяной бане при 95
7.Пользуемся и High и Low pH Отлетает где то 1 из 15-20 стекол, в основном при выраженном фиброзе: леченные молочные железы и т.п.
|
| |
| |
| oksana | Дата: Вторник, 2007-10-23, 10:41 PM | Сообщение # 7 |
|
Рядовой
Группа: Проверенные
Сообщений: 1
Статус: Offline
| Добрый вечер, а взамен полилизина посоветуйте что-нибудь, пожалуйста!!
be inspired
Сообщение отредактировал oksana - Вторник, 2007-10-23, 10:42 PM |
| |
| |
| new | Дата: Среда, 2007-10-24, 0:09 AM | Сообщение # 8 |
|
Мастер цифровой микроскопии
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 27
Статус: Offline
| а взамен полилизина посоветуйте что-нибудь, пожалуйста!! Берем пол литра дистилированной воды, подогреваем до 60 С, растворяем в ней 1,5 г желатина и добавляем 0,25 гхром-калиевых
квасцов. Далее, чистые, обезжиренные стекла опускаем в данный раствор при 50 С , далее высушиваем в термостате при 37 С всю ночь (в коробочке, для избежания попадания пыли). После резки материала, срезы на этих стеклах 2-3 часа должны сушиться
при комнатной температуре в вертик. положении, и перед окрашиванием 30-40 мин в термостате при 55-57 С.
Удачи!!!!!
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Среда, 2007-10-24, 6:24 AM | Сообщение # 9 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Quote (oksana) а взамен полилизина посоветуйте что-нибудь, пожалуйста!!
+ заряженные стекла
|
| |
| |
| 44334433 | Дата: Пятница, 2008-03-21, 9:59 AM | Сообщение # 10 |
|
Рядовой
Группа: Проверенные
Сообщений: 1
Статус: Offline
| На обычные стекла ваткой наносим раствор альбумина примерно 40 %, сушим эти стекла на электрической плитке с закрытой спиралью. Некоторые стекла могут лопнуть их выкидываем, если поверхность стекла с альбумином сильно темнеет – слой белка слишком толстый, нужно делать потоньше. В ванну (темп.- 45 С) для расправления срезов также пускаем несколько грамм альбумина на 100 мл (на глаз). Затем сушим в термостате сутки при 37-40 С. Затем можно ставить стандартную иммуногистохимическую реакции. Фонового окрашивания не наблюдается, процент отлипших срезов небольшой, чаще вообще не чего не отлипает.
|
| |
| |
| niksavelov | Дата: Понедельник, 2008-03-24, 5:38 PM | Сообщение # 11 |
|
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Quote (new) Берем пол литра дистилированной воды, подогреваем до 60 С, растворяем в ней 1,5 г желатина
и добавляем 0,25 гхром-калиевых квасцов.
Использовать желатин крайне не рекомендую - может возникать выраженное фоновое окрашивание. Самый же дешевый метод - научить лаборанта делать тонкие ровные срезы без полосок и пузырей (для этого могут так же потребоваться одноразовые ножи). Ну и конечно срезы надо хорошо высушивать. Quote (alexmorph) В термостате при 37 на ночь (12-18 часов)
Этого вполне достаточно для качественного среза.
Никита Савёлов
|
| |
| |
|
|
