Хромогены - Страница 2 - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Четверг, 2017-05-25, 11:33 AM

Страница 2 из 2«12
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Хромогены
Хромогены
VladpathologДата: Вторник, 2012-08-14, 6:32 PM | Сообщение # 16
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Огромное спасибо, буду экспериментировать.
 
VladpathologДата: Среда, 2012-08-15, 2:39 PM | Сообщение # 17
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Буду пытаться усилить окрашивание DAB применив сульфат меди (двойная метка будет DAB/AEC). Вот только не понял как это сделать. Рецепт приведен такой:

1. Incubate in DAB solution for 10 mins
2. Wash in running tap water.
3. Incubate in 0.5% copper sulphate in 0.9% sodium chloride for 10 mins.Wash in running tap water.
The HRP probed antigen apear in black/brown.

Проблема первая- " 0.5% copper sulphate in 0.9% sodium chloride ". Для тупого - сколько нужно чего смешать чтобы получить нужный раствор? У меня есть 0,9% NaСl (бочка) и сульфат меди в порошке.
Проблема вторая - При использовании двойной метки - это эффект "чернения" мне нужен только на DAB, а у меня еще будет вторая метка из AEC. Вопрос - AEC не почернеет. Или другой вариант - сначала DAB, потом сульфат меди, потом AEC. Тогда вопрос другой - после сульфата меди AEC - работать будет?

Еще вопрос - есть техники с использованием сульфата никеля - это для меня экзотика, если только в Норильск на НорНикель слетать.
Nickel enhancement of DAB:
DAB (0.5 mg/ml) with 0.08% nickel sulfate and 3% H2O2:
Volume needed: 1 ml

2% nickel sulfate 40 ul
DAB Solution 1 ml
30% H2O2 10 ul
To make: 2% Nickel sulfate, NiSO4.6H2O: 0.9 g into 45 ml E-pure dd H2O = 2% solution. Keep in Fridge.
(Dilute: 1/25 to give a 0.08% solution.)


Но у меня есть например хлорид цинка - тоже вроде соль и тоже метала. Может и с ним можно чего-нибудь придумать.
 
MaximДата: Четверг, 2012-08-16, 0:14 AM | Сообщение # 18
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 499
Репутация: 25
Статус: Offline
Всякие добавки тяжелых металлов нужны только для усиления цвета ДАБ (если есть какие-то прблемы с этим). На АЕС они никак не повлияют, но перед АЕС должна быть хорошая промывка (как впрочем после любого этапа ИГХ). В обычных случаях ДАБ нармально зачерняется, если после этапа ДАБ поместить стекла на 3-5 мин в обычную водопроводную, а не дистиллированную или деоинизированную воду. Другое дело, если антигена слишком мало для визуализации. Тогда мало что поможет.

Спрашиваемые рецепты будут выглядеть так:
на 100 мл:
0.5 г сернокислой меди
0.9 г натрия хлорида
100 мл деионизированной воды
Растворить медь в воде до счезновения кристаллов. Затем добавить хлорид натрия и растворять также до полного исчезновения кристаллов. Это быстрее и проще делать на магнитной мешалке.

Если на 250 мл:
1,25 г сернокислой меди
2,25 г натрия хлорида
250 мл деиоинизированной воды

Лучше это счастье использовать одноразово и не хранить несколько дней.
 
VladpathologДата: Четверг, 2012-08-23, 5:37 PM | Сообщение # 19
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Сделал, все по рецепту - эффекта "ноль". Сделал дичайшую концентрацию раствора - эффект тот же, т.е. нолевой. Думаю где достать хлорид никеля или кобальта. Хоть в Норильск на НорНикель выезжай smile
Пока AEC хромоген не пришел. Остается надежда, что смогу и без усиления DAB различить метки.
Впрочем можно будет конечно в фотошопе инвертировать цвета, замутить этакую псевдоиммунофлюорисценцию, чтобы усилить различия оттенков, но это конечно возня та ещё.
 
MaximДата: Четверг, 2012-08-23, 9:31 PM | Сообщение # 20
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 499
Репутация: 25
Статус: Offline
Так для чего все-таки нужен бешено черный цвет ДАБ? Всего лишь для контраста?
ДАБ и так достаточно интенсивно все выкрашивает, даже просроченный.
Если интенсивность реакции с ДАБ оставляет желать лучшего, проверьте две вещи: адекватность фиксации и чистоту реактивов в батарее для депарафинирования. Если парафин удалется неполностью - не будет никаких нормальных реакций. Лаборанты могут утверждать что угодно - убедитесь сами, что все чистое и хорошее. Проверка этого этапа либо решит проблему, либо покажет другие пути решения.

Увеличение концентрации ионов металла бессмыслено. С ДАБ прореагирует только строго определенное количество ионов металла, которое намного меньше 0.01%.
 
VladpathologДата: Пятница, 2012-08-24, 2:38 PM | Сообщение # 21
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Проблема пока надуманная, но я ожидаю хромоген - АЕС, который вроде как должен быть красным или около того.
Мне нужно будет добиться двойного окрашивания - вроде АЕС-ядро, DAB-мембрана или наоборот.
Но вот мне прислали реальное фото этого самого АЕС в действии.



Как видите, не такой уж оно и красный этот АЕС, вот я и ищу способ увеличить контраст между DAB и AEC.
Может и зря, может и так будет достаточно отличимо.
 
MaximДата: Пятница, 2012-08-24, 9:58 PM | Сообщение # 22
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 499
Репутация: 25
Статус: Offline
Теперь понятно стало. Дейтвительно, в этом случае есть риск совпадения цветов. Тогда прийдется точно колдовать компьютеными эффектами.
Не лучше ли взять щелочную фосфатазу или новый фуксин, который также Дако выпускает?
В крайнем случае может быть даже дешевле будет разнести антигены на разные стекла.
Здесь же еще нужно учитывать тот факт, что водная среда для заключения будет иметь более низкий коэффциент
преломления, чем ксилол и смазанность картины будет так или иначе заметна.
А какие антигены планируете выявлять одновременно?
 
VladpathologДата: Суббота, 2012-08-25, 6:20 AM | Сообщение # 23
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Здесь могу сказать, что одни ядерные антигены, другие мембранные или цитоплазматические. Остальное в личку напишу wink
 
RomanДата: Понедельник, 2012-08-27, 10:32 AM | Сообщение # 24
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Встретил статью, где используется двойное окрашивание с "голубым хромогеном". Может будет полезно для Вас Vladpatholog. Метод довольно подробно описан.

От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
VladpathologДата: Четверг, 2012-08-30, 4:38 PM | Сообщение # 25
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Спасибо Roman, изучу.
 
niksavelovДата: Пятница, 2012-12-14, 11:50 PM | Сообщение # 26
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Дорогой Влад. Чем закончилась эпопея с двойным мечением, если не секрет?

Никита Савёлов
 
VladpathologДата: Понедельник, 2012-12-17, 1:03 AM | Сообщение # 27
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
А пока ничем. Всё жду когда до меня доедет этот aec-чудо хромоген. Ну а там посмотрю на сколько он красный в жизни. Если чего нашлись фирмы готовые помочь купить черные, пурпурные и т.п. хромогены.
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Хромогены
Страница 2 из 2«12
Поиск: