Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2024-04-19, 6:04 PM
|
Способы устранения фонового окрашивания
|
|
| lab_nsk | Дата: Пятница, 2010-12-03, 4:30 PM | Сообщение # 31 |
 Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Статус: Offline
| У меня время обработки меньше - 7 минут (также 3% раствором). Попробую увеличить.
Твина сколько добавлять? я в промывочный буфер добавляла 6 мкл твина на 600 мл буфера. А с перекисью как?
И потом, если не сложно, объясните зачем необходим ЕДТА, вроде ацетат только кальций "берет". А он, исходя из статьи, представленной на этом форуме, итак разрушается при обработке в микроволновке (срезы в цитрате)?
|
| |
| |
| niksavelov | Дата: Пятница, 2010-12-03, 4:48 PM | Сообщение # 32 |
|
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| 1 мл Tween 20 растворить в 400 мл 3% водного р-ра Н2О2.
До конца механизм работы EDTA не известен. Для меня очевидны две вещи: 1. EDTA более эффективный хелатор ионов кальция чем цитрат. 2. Буферы с EDTA имеют щелочной рН и в них происходит слабый щелочной гидролиз, способствующий восстановлению структуры большинства конформационных эпитопов, разрушенных при формалиной фиксации.
Никита Савёлов
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Суббота, 2010-12-04, 4:54 AM | Сообщение # 33 |
 ___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Quote (lab_nsk) Подскажите, молоко ведь должно быть обезжиренным? и соответственно, когда ставлю слайды в холодильник, разведение надо взять побольше?
Обезжиренное молоко (приготавливать из магазинного порошка, для экономии и для научных целей в самый раз!). IHC World - skim milk.
Первичное антитело можно сильнее развести (меньшая концентрация).
Quote (Maxim) Уважаемый Pathologoanatom! Поделитесь, пожалуйста, ссылкой про молоко. Просто интересно.
Уважаемый Maxim. Методику опубликовали Miller RT, Kubier P, Reynolds B et al: Blocking of endogenous avidin-binding activity in immunohistochemistry: The use of skim milk as an economical and effective substitute for commercial biotin solutions. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 7(1):63-65, 1999.
Суть кратко описана на IHC World. Dabbs в поледнем издании тоже ссылается на Miller R.T. et al.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2010-12-04, 9:56 PM | Сообщение # 34 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Спасибо за ссылки, Pathologoanatom!
Сайт знакомый, да не все прочел на нем. lab_nsk:
ЭДТА и цитрат оба хорошо связывают кальций. Это свойство чаще используют в гистологии для удаления кальция.
Если бы вся проблема демаскировки заключалась в связывании кальция, то и проблем бы не было. А тут нужно разрушить перекрестные связи белков с формалином и для этого прибегают к нагреванию в буферах. Вот и мучаемся мы все, разрушая за 20-40 минут при нагревании в буферах с рН 7 или 9 химические связи, которые образовались в течение 24-48 часов (фиксация). Вся трудность в том, что сначала ткани должны быть тщательно зафиксированы, а потом также тщательно восстановлены. Оба процесса мучительные и неизбежные для большинства антигенов.
|
| |
| |
| Беляш | Дата: Суббота, 2011-01-22, 11:21 AM | Сообщение # 35 |
|
Лейтенант
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 9
Статус: Offline
| Для устранения фонового окрашивания очень помогает авидин-биотиновый блок, особенно при работе с тканями с высоким уровнем эндогенного биотина (печень, почки, селезенка). Нас он просто спас;) Подробности можно прочитать на ihcworld.
|
| |
| |
| niksavelov | Дата: Понедельник, 2011-01-24, 8:49 AM | Сообщение # 36 |
|
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Для устранения фонового окрашивания при котором очень помогает авидин-биотиновый блок, так же очень помогает использование полимерных систем детекции вместо страптавидин-биотиновых!
Никита Савёлов
|
| |
| |
| Беляш | Дата: Вторник, 2011-01-25, 7:31 PM | Сообщение # 37 |
|
Лейтенант
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 9
Статус: Offline
| Quote (niksavelov) Для устранения фонового окрашивания при котором очень помогает авидин-биотиновый блок, так же очень помогает использование полимерных систем детекции вместо страптавидин-биотиновых!
Никита, иногда, по ряду причин, люди вынуждены использовать именно стрептавидин-биотиновую систему детекции;)
|
| |
| |
| niksavelov | Дата: Вторник, 2011-01-25, 11:35 PM | Сообщение # 38 |
|
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Если не секрет - это причины технологического или финансового свойства?
Никита Савёлов
|
| |
| |
| Беляш | Дата: Воскресенье, 2011-01-30, 8:44 AM | Сообщение # 39 |
|
Лейтенант
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 9
Статус: Offline
| Quote (niksavelov) Если не секрет - это причины технологического или финансового свойства?
Причина проста: на данный момент в лаборатории используется стрептавидин-биотиновая система детекции, поэтому пока приходится работать на том, что есть. А вот ежели мне захочется что-то изменить, то проблемы финансового свойства, думаю, выйдут на первый план;)
|
| |
| |
| Haric | Дата: Воскресенье, 2011-07-10, 6:21 PM | Сообщение # 40 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Добрый день! Нуждаюсь в совете.
Мы проводим исследование кожи при различных заболеваниях. Требуется визуализировать в биоптатах кожи (фикс. формалином) субпопуляцию Т17-хелперов. Маркерами этих клеток могут служить ИЛ17 и ядерный рецептор RORC (Retinoid-related orphan receptors gamma). Мы выбрали последний, использовали антитела от Abcam - ROR gamma antibody, ab78007. Вышло неказисто - мощное окрашивание всего эпидермиса и всех клеток дермы (цитоплазма и мембрана). Идентифицировать клетки невозможно. До этого было выполнена ИГХ Foxp3 (для визуализации Т-регуляторных клеток) - получен прекрасный результат. Система визуализации одна и та же - Envision (Dako, Дания), хромоген - ДАБ. Остальное все по общепринятой методике - истощение пероксидазы, демаскировка антигенов (нагревания в соотв. растворах в течение 30 мин. при температуре 95°С в водяной бане). Инкубацию срезов с первичными антителами проводили в течение 18 ч. при температуре +4°С, инкубацию с системой визуализации - 30 мин. при комнатной температуре, для проявления результата реакции ДАБ наносили на срезы на 5 мин.
Подскажите, пожалуйста, кто-нибудь работал на коже с антителами к RORC? Может быть есть опыт исследования Т17-хелперов другими антителами.
Как можно выложить фотографии препаратов. Вот ссылка на фото: *****
Заранее спасибо. Владислав.
|
| |
| |
| lab_nsk | Дата: Понедельник, 2011-07-11, 11:41 AM | Сообщение # 41 |
|
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Quote (Haric) при комнатной температуре, для проявления результата реакции ДАБ наносили на срезы на 5 мин.
Мне кажется, что это многовато. Я когда красила кожу, правда на другое Ат, под контролем микроскопа хватало около 40 секунд на ДАБ.
Попробуйте тоже поконтролировать под микроскопом и вероятно взяли бОльшую концентрацию, чем нужно.
Так же, по моему опыту, Abcam'овские Ат работают всегда безотказно.
Удачи (:
|
| |
| |
| Haric | Дата: Понедельник, 2011-07-11, 11:18 PM | Сообщение # 42 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Спасибо за совет! Пробовали концентрацию уменьшать, не помогает. Это новые антитела у Abcam.
|
| |
| |
| Anitra | Дата: Вторник, 2011-07-19, 11:55 PM | Сообщение # 43 |
 Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Статус: Offline
| При использовании стрептавидин-биотиновых систем обычно и правда хорошо помогает биотин-блок, например http://www.springbio.com/documents/DBBXXXAvidin_Biotin_RUO_A.pdf
Это обычно 2х-компонентный реактив
Вначале инкубируем с раствором стрептавидина
Потом со свободным биотином
Получается что все лишнее связывается.
Опять же протеиновый блок
Также можно поэкспериментировать с промывками (например использовать буфер с твином)
Увеличить время промывок...
Время и температура инкубации с антителом тоже важно.
Сейчас жарко... Далеко не рум темпрече....  Может стоит убирать стекла в термостат с постоянными 25 градусами.
Снизить время инкубации.
Но все равно желаю вам безбиотиновой системы детекции!
ЗЫ: в последнее время слышала плохие отзывы на Абкам от сибиряков. Даже странно. Тут все так хвалят...
Червяк длинный, а жизнь короткая
Сообщение отредактировал Anitra - Вторник, 2011-07-19, 11:59 PM |
| |
| |
| Haric | Дата: Среда, 2011-07-20, 7:33 AM | Сообщение # 44 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Спасибо за совет! С твином экспериментировали, с экспозицией и температурой тоже. Нет специфичности. Эндотелиоциты красятся ярче, чем лимфоциты. Отправили рекламацию в Abcam...
|
| |
| |
| Anitra | Дата: Среда, 2011-07-20, 11:36 PM | Сообщение # 45 |
|
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Статус: Offline
| Прямо-таки загадка... Надеюсь что когда придет ответ вы с нами поделитесь.
Любопытно чем дело кончится.
Червяк длинный, а жизнь короткая
|
| |
| |
|
|
