Способы устранения фонового окрашивания - Форум
 
Способы устранения фонового окрашивания - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2016-12-09, 12:43 PM

Страница 1 из 3123»
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Способы устранения фонового окрашивания
Способы устранения фонового окрашивания
PatologoanatomДата: Пятница, 2009-09-04, 7:43 PM | Сообщение # 1
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 743
Репутация: 11
Статус: Offline
Для устранения фонового окрашивания можно предпринять:
протитровать антитело (развести а разных соотношениях);
подержать стекла в растворе перекиси водорода 0,04% с метанолом в течение 10 мин до накладывания первичного антитела;
подержать стекла в растворе перекиси водорода 0,04% с обезжиренным молоком (приготавливать из порошка) в течение 20-30 мин до накладывания первичного антитела;
использовать для разведения первичного антитела DAKO antibody diluent with reducing background component;
использовать DAKO Protein block (CodeX0909);
сменить систему детекции, вместо LSAB использовать Envision+;
в промывочном буфере использовать компонент Tween-20.
Еще один хороший способ устранения фона: overnight staining. Наложить первичное антитело в большем разведении (меньшей концентрации) на стекла, поместить их в инкубаторе в холодильник (+4oC) на ночь, вторичные антитела накладывать на следующий день, после промывки естественно. И рекомендую очень хорошо промывать стекла после вторичного антитела. Если промыть недостаточно можно получить грязноватый фон, распространяющийся не только на ткань, но и на окружающее стекло в виде буроватого преципитата. Маркер, спешащего гистотехнолога.
 
RomanДата: Среда, 2009-09-16, 6:26 PM | Сообщение # 2
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Прошу совета.
Проводим ИГХ на ткани эндометрия (парафин) с VEGF(дако, клон VG1), демаскировка в микроволновке, использовали разведение 1:50, инкубация 40 мин, получили специфическую и фоновую окраску. Боролись с последней путем большего разведения первичных антител 1:100 и 1:200, разведение 1:50 также использовали. Все инкубировали в холодильнике в течение ночи, реакция (специфическая и неспецифическая) полностью отсутствовала. Может ли быть причиной невозможность реакции антиген-антитело при низкой температуре (+4 С)?
P.S. Возможно, что в первый раз фон был обусловлен некачественным ДАВ-хромогеном (был преципитат после разведения)


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
niksavelovДата: Вторник, 2009-10-06, 2:16 PM | Сообщение # 3
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Quote (Roman)
Может ли быть причиной невозможность реакции антиген-антитело при низкой температуре (+4 С)?

Вряд ли. Замена инкубации первых антител в течение 40 мин. при +20С на инкубацию в течение ночи при +4С наоборот должна привести к 2-4 кратному увеличению титра антител, а не к его снижению.

Вопрос в том, что вообще была ли специфическая реакция или только фоновая окраска (в одних местах сильнее, в других слабее)? На сколько я знаю, клон VG1 не самый лучший клон к VEGF. Он требует "жёсткую" демаскировку в буферах с выким рН и чувствительную систему детекции.


Никита Савёлов
 
RomanДата: Суббота, 2009-10-10, 6:26 PM | Сообщение # 4
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Уважаемый niksavelov, а на сколько жесткая должна быть демаскировка и насколько высоким рН. Мы проводили демаскировку кипячением в микроволновке 2 раза по 5 минут в цитратном буфере рН 6,0
На счет специфичности - вроде была таковая не во всех правда срезах - ярко-коричневые пылевидные гранулы в цитоплазме клеток трофобластических (инвазивный трофобласт) и децидуальных на общем бледно-коричневом фоне


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
niksavelovДата: Понедельник, 2009-10-12, 8:37 AM | Сообщение # 5
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Quote (Roman)
на сколько жесткая должна быть демаскировка и насколько высоким рН. Мы проводили демаскировку кипячением в микроволновке 2 раза по 5 минут в цитратном буфере рН 6,0

Я несколько лет уже не работал с микроволновкой, поэтому могу дать совет, основанный только на общих соображениях. На сколько я помню, кипячение в микроволновке в большинстве протоколов производится в течении 15 минут (5+5+5 или 7+7). Буфер с высоким рН это, обычно, 10мМ Tris/ 1мМ EDTA (рН=9.0). Получают его следующим образом:
1,21 г Tris
0,37 г EDTA
1000 мл dH2O
http://www.nordiqc.org/Techniques/Epitope_retrieval.htm
Формула рассчитана так, что рН получается 9.0-9.1, поэтому титровать буфер щёлочью или кислотой не требуется. Раствор может храниться при комнатной температуре не менее 1 мес. Мы, обычно, готовили 10х раствор и хранили его при комнатной температуре. Растворять надо сначала навеску Tris, а уже после этого EDTA. EDTA лучше брать ди-натриевую соль. Она хоть как-то растворяется в щелочной среде (в растворе Tris). Так же, лучше использовать магнитную мешалку, а не стеклянную палочку в руке лаборанта.

Удачи. smile


Никита Савёлов
 
RomanДата: Понедельник, 2009-10-12, 5:04 PM | Сообщение # 6
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Спасибо, так уж приходиться работать с подручными средствами
Может микроволновку сменить на скороварку. smile В каком режиме можно проводить демаскировку в ней?


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
niksavelovДата: Понедельник, 2009-10-12, 8:42 PM | Сообщение # 7
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Quote (Roman)
Может микроволновку сменить на скороварку. В каком режиме можно проводить демаскировку в ней?

А скороварка какая?


Никита Савёлов
 
RomanДата: Вторник, 2009-10-13, 5:10 PM | Сообщение # 8
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
обычная бытовая: кастрюля с кипящей водой (буфером) с плотно закрывающейся крышкой с клапаном, при кипении создается некоторое давление внутри (наверно около 1,2-1,5атм), или что вы имеете ввиду

От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
PatologoanatomДата: Среда, 2009-10-14, 10:38 PM | Сообщение # 9
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 743
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (Roman)
Мы проводили демаскировку кипячением в микроволновке 2 раза по 5 минут в цитратном буфере рН 6,0

Для каждого антитела оптимальным является буферный раствор, прописанный в упакованной к нему инструкции.
 
niksavelovДата: Четверг, 2009-10-15, 10:51 PM | Сообщение # 10
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Quote (Roman)
обычная бытовая: кастрюля с кипящей водой (буфером) с плотно закрывающейся крышкой с клапаном

Видел однажды такую в одной лаборатории. У неё ещё морковки на крышке были изображены. Сам таким девайсом никогда не пользовался, поэтому совет дать не могу.

Quote (Patologoanatom)
Для каждого антитела оптимальным является буферный раствор, прописанный в упакованной к нему инструкции.

С этим решительно не согласен! Это утверждение справедливо только в том случае, если в лаборатории первые антитела, раствор для разведения антител, буферы для демаскировки и система детекции от одного производителя. Т.е. в той ситуации, когда выбирать, собственно, и не приходится. Но когда есть выбор, то лучше следовать рекомендациям американского специального комитета по стандартизации ИГХ, которые гласят:
"Рекомендация 7.
Оптимизация нового антитела должна включать, если это необходимо, серийное тестирование и модификацию следующего: демаскировки антигенов, титра антител, системы детекции. … Минимум 2 типа растворов для демаскировки, 5 различных титров антител (включая как минимум один ниже и один выше рекомендованных производителем) и как минимум 2 типа или времени инкубации системы детекции с хромогеном." smile
N Goldstein et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2007; 15: 124–133.


Никита Савёлов
 
PatologoanatomДата: Четверг, 2009-10-15, 11:25 PM | Сообщение # 11
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 743
Репутация: 11
Статус: Offline
Уважаемый niksavelov,
Благодарю за напоминание аналитической концепции ИГХ. Это я перепутал комментарии к рекомендации 4. "Satisfactory antibody staining is usually achieved by strictly following the manufacturer’s package insert instructions". wacko
 
RomanДата: Пятница, 2009-10-16, 10:33 PM | Сообщение # 12
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Многое начинает проясняться: если с титром антител понятно, то какие 2 типа буферных растворов для демаскировки можно использовать ( с разным рН?). Дако, например, советует использовать собственные растворы для демаскировки. Так ли это важно и есть для них замена, произведенная кустарным способом?

Добавлено (2009-10-16, 10:33 Pm)
---------------------------------------------
И еще хочу спросить: после однократного использования буфера для демаскировки его принято выливать в раковину или использовать повторно?


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
PatologoanatomДата: Пятница, 2009-10-16, 10:36 PM | Сообщение # 13
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 743
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (Roman)
то какие 2 типа буферных растворов для демаскировки можно использовать ( с разным рН?)

Для Dako это: DTRS low pH (кустарный аналог цитратный буфер с добавкой Tween-20) и DTRS high pH (кустарный аналог ЭДТА).
 
PatologoanatomДата: Пятница, 2009-10-16, 10:40 PM | Сообщение # 14
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 743
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (Roman)
И еще хочу спросить: после однократного использования буфера для демаскировки его принято выливать в раковину или использовать повторно?

После подогрева в микроволновке и остывания стекол - вылить.
Лучше наболтать 10х (10-кратного) буфера и хранить в большой бутыли, а по мере необходимости применения разбавлять в dH2O до 1х (1-кратного) и в микроволнову (пароваркку, скороварку, рисоварку) со стеклами.
 
RomanДата: Суббота, 2009-10-17, 5:44 PM | Сообщение # 15
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Уважаемый Patologoanatom, замечал ранее, что у вас есть опыт пользования рисоваркой.
Как вы помещали в нее стекла: в контейнере, на дно? Расход буфера получается большой в первом случае.


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Способы устранения фонового окрашивания
Страница 1 из 3123»
Поиск: