Вы вошли как Гость
Текущая дата: Среда, 2024-04-24, 1:41 AM
|
Способы устранения фонового окрашивания
|
|
| Patologoanatom | Дата: Пятница, 2009-09-04, 7:43 PM | Сообщение # 1 |
 ___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Для устранения фонового окрашивания можно предпринять:
протитровать антитело (развести а разных соотношениях);
подержать стекла в растворе перекиси водорода 0,04% с метанолом в течение 10 мин до накладывания первичного антитела;
подержать стекла в растворе перекиси водорода 0,04% с обезжиренным молоком (приготавливать из порошка) в течение 20-30 мин до накладывания первичного антитела;
использовать для разведения первичного антитела DAKO antibody diluent with reducing background component;
использовать DAKO Protein block (CodeX0909);
сменить систему детекции, вместо LSAB использовать Envision+;
в промывочном буфере использовать компонент Tween-20.
Еще один хороший способ устранения фона: overnight staining. Наложить первичное антитело в большем разведении (меньшей концентрации) на стекла, поместить их в инкубаторе в холодильник (+4oC) на ночь, вторичные антитела накладывать на следующий день, после промывки естественно. И рекомендую очень хорошо промывать стекла после вторичного антитела. Если промыть недостаточно можно получить грязноватый фон, распространяющийся не только на ткань, но и на окружающее стекло в виде буроватого преципитата. Маркер, спешащего гистотехнолога.
|
| |
| |
| Roman | Дата: Среда, 2009-09-16, 6:26 PM | Сообщение # 2 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Прошу совета.
Проводим ИГХ на ткани эндометрия (парафин) с VEGF(дако, клон VG1), демаскировка в микроволновке, использовали разведение 1:50, инкубация 40 мин, получили специфическую и фоновую окраску. Боролись с последней путем большего разведения первичных антител 1:100 и 1:200, разведение 1:50 также использовали. Все инкубировали в холодильнике в течение ночи, реакция (специфическая и неспецифическая) полностью отсутствовала. Может ли быть причиной невозможность реакции антиген-антитело при низкой температуре (+4 С)?
P.S. Возможно, что в первый раз фон был обусловлен некачественным ДАВ-хромогеном (был преципитат после разведения)
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| niksavelov | Дата: Вторник, 2009-10-06, 2:16 PM | Сообщение # 3 |
|
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Quote (Roman) Может ли быть причиной невозможность реакции антиген-антитело при низкой температуре (+4 С)?
Вряд ли. Замена инкубации первых антител в течение 40 мин. при +20С на инкубацию в течение ночи при +4С наоборот должна привести к 2-4 кратному увеличению титра антител, а не к его снижению. Вопрос в том, что вообще была ли специфическая реакция или только фоновая окраска (в одних местах сильнее, в других слабее)? На сколько я знаю, клон VG1 не самый лучший клон к VEGF. Он требует "жёсткую" демаскировку в буферах с выким рН и чувствительную систему детекции.
Никита Савёлов
|
| |
| |
| Roman | Дата: Суббота, 2009-10-10, 6:26 PM | Сообщение # 4 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Уважаемый niksavelov, а на сколько жесткая должна быть демаскировка и насколько высоким рН. Мы проводили демаскировку кипячением в микроволновке 2 раза по 5 минут в цитратном буфере рН 6,0
На счет специфичности - вроде была таковая не во всех правда срезах - ярко-коричневые пылевидные гранулы в цитоплазме клеток трофобластических (инвазивный трофобласт) и децидуальных на общем бледно-коричневом фоне
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| niksavelov | Дата: Понедельник, 2009-10-12, 8:37 AM | Сообщение # 5 |
|
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Quote (Roman) на сколько жесткая должна быть демаскировка и насколько высоким рН. Мы проводили демаскировку кипячением в микроволновке 2 раза по 5 минут в цитратном буфере рН 6,0
Я несколько лет уже не работал с микроволновкой, поэтому могу дать совет, основанный только на общих соображениях. На сколько я помню, кипячение в микроволновке в большинстве протоколов производится в течении 15 минут (5+5+5 или 7+7). Буфер с высоким рН это, обычно, 10мМ Tris/ 1мМ EDTA (рН=9.0). Получают его следующим образом:
1,21 г Tris
0,37 г EDTA
1000 мл dH2O
http://www.nordiqc.org/Techniques/Epitope_retrieval.htm
Формула рассчитана так, что рН получается 9.0-9.1, поэтому титровать буфер щёлочью или кислотой не требуется. Раствор может храниться при комнатной температуре не менее 1 мес. Мы, обычно, готовили 10х раствор и хранили его при комнатной температуре. Растворять надо сначала навеску Tris, а уже после этого EDTA. EDTA лучше брать ди-натриевую соль. Она хоть как-то растворяется в щелочной среде (в растворе Tris). Так же, лучше использовать магнитную мешалку, а не стеклянную палочку в руке лаборанта. Удачи. 
Никита Савёлов
|
| |
| |
| Roman | Дата: Понедельник, 2009-10-12, 5:04 PM | Сообщение # 6 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Спасибо, так уж приходиться работать с подручными средствами
Может микроволновку сменить на скороварку. В каком режиме можно проводить демаскировку в ней?
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| niksavelov | Дата: Понедельник, 2009-10-12, 8:42 PM | Сообщение # 7 |
|
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Quote (Roman) Может микроволновку сменить на скороварку. В каком режиме можно проводить демаскировку в ней?
А скороварка какая?
Никита Савёлов
|
| |
| |
| Roman | Дата: Вторник, 2009-10-13, 5:10 PM | Сообщение # 8 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| обычная бытовая: кастрюля с кипящей водой (буфером) с плотно закрывающейся крышкой с клапаном, при кипении создается некоторое давление внутри (наверно около 1,2-1,5атм), или что вы имеете ввиду
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Среда, 2009-10-14, 10:38 PM | Сообщение # 9 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Quote (Roman) Мы проводили демаскировку кипячением в микроволновке 2 раза по 5 минут в цитратном буфере рН 6,0
Для каждого антитела оптимальным является буферный раствор, прописанный в упакованной к нему инструкции.
|
| |
| |
| niksavelov | Дата: Четверг, 2009-10-15, 10:51 PM | Сообщение # 10 |
|
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Статус: Offline
| Quote (Roman) обычная бытовая: кастрюля с кипящей водой (буфером) с плотно закрывающейся крышкой с клапаном
Видел однажды такую в одной лаборатории. У неё ещё морковки на крышке были изображены. Сам таким девайсом никогда не пользовался, поэтому совет дать не могу. Quote (Patologoanatom) Для каждого антитела оптимальным является буферный раствор, прописанный в упакованной к нему инструкции.
С этим решительно не согласен! Это утверждение справедливо только в том случае, если в лаборатории первые антитела, раствор для разведения антител, буферы для демаскировки и система детекции от одного производителя. Т.е. в той ситуации, когда выбирать, собственно, и не приходится. Но когда есть выбор, то лучше следовать рекомендациям американского специального комитета по стандартизации ИГХ, которые гласят:
"Рекомендация 7.
Оптимизация нового антитела должна включать, если это необходимо, серийное тестирование и модификацию следующего: демаскировки антигенов, титра антител, системы детекции. … Минимум 2 типа растворов для демаскировки, 5 различных титров антител (включая как минимум один ниже и один выше рекомендованных производителем) и как минимум 2 типа или времени инкубации системы детекции с хромогеном."
N Goldstein et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2007; 15: 124–133.
Никита Савёлов
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Четверг, 2009-10-15, 11:25 PM | Сообщение # 11 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Уважаемый niksavelov,
Благодарю за напоминание аналитической концепции ИГХ. Это я перепутал комментарии к рекомендации 4. "Satisfactory antibody staining is usually achieved by strictly following the manufacturer’s package insert instructions". 
|
| |
| |
| Roman | Дата: Пятница, 2009-10-16, 10:33 PM | Сообщение # 12 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Многое начинает проясняться: если с титром антител понятно, то какие 2 типа буферных растворов для демаскировки можно использовать ( с разным рН?). Дако, например, советует использовать собственные растворы для демаскировки. Так ли это важно и есть для них замена, произведенная кустарным способом? Добавлено (2009-10-16, 10:33 Pm)
---------------------------------------------
И еще хочу спросить: после однократного использования буфера для демаскировки его принято выливать в раковину или использовать повторно?
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Пятница, 2009-10-16, 10:36 PM | Сообщение # 13 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Quote (Roman) то какие 2 типа буферных растворов для демаскировки можно использовать ( с разным рН?)
Для Dako это: DTRS low pH (кустарный аналог цитратный буфер с добавкой Tween-20) и DTRS high pH (кустарный аналог ЭДТА).
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Пятница, 2009-10-16, 10:40 PM | Сообщение # 14 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Quote (Roman) И еще хочу спросить: после однократного использования буфера для демаскировки его принято выливать в раковину или использовать повторно?
После подогрева в микроволновке и остывания стекол - вылить.
Лучше наболтать 10х (10-кратного) буфера и хранить в большой бутыли, а по мере необходимости применения разбавлять в dH2O до 1х (1-кратного) и в микроволнову (пароваркку, скороварку, рисоварку) со стеклами.
|
| |
| |
| Roman | Дата: Суббота, 2009-10-17, 5:44 PM | Сообщение # 15 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Уважаемый Patologoanatom, замечал ранее, что у вас есть опыт пользования рисоваркой.
Как вы помещали в нее стекла: в контейнере, на дно? Расход буфера получается большой в первом случае.
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
|
|
