Double immunostaining method - Форум
 
Double immunostaining method - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Понедельник, 2016-12-05, 7:22 AM

Страница 1 из 11
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Double immunostaining method
Double immunostaining method
PavelДата: Суббота, 2009-09-26, 4:00 PM | Сообщение # 1
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 30
Репутация: 0
Статус: Offline
Уважаемые коллеги!
Мы занимаемся определением М-клеток в гистологических срезах тонкого кишечника и Меккелевого дивертикула птицы. В единственной доступной нам публикации мы обнаружили название моноклонального антитела к М-клеткам, которое рекомендует автор статьи - это mouse antycytokeratin 18. В листе-вкладыше на это антитело не написано, что оно используется для определения М-клеток, а для определения лектинов и др. Мы прокрасили криостатные срезы с использованием стрептавидин-биотиновой тест-системы. Прокрасился исключительно эпителий, то есть то место, где локализуются интересующие нас клетки. Однако, окраска носила диффузный характер, без четкого определения клеток. В этой же статье написано, что рекомендованный метод для определения этих клеток - метод двойного иммуноокрашивания. с использованием моноклональных антител к М-клеткам, CD3, CD45, Lectin. Моноклональные антитела к CD3 у меня есть. Подскажите, пожалуйста, протокол процедуры окрашивания по методу двойной иммуноокраски. Как мне отдифференцировать один тип клетки от другого в результате этой окраски. Есть ли у Вас фотографиии с окраской срезов по данному методу? Можно ли использовать стрептавидин-биотиновую тест-систему для этого метода?
 
VladpathologДата: Суббота, 2009-09-26, 5:35 PM | Сообщение # 2
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Для этого нужна специальная система. Очень дорого получается. Из подручных средств не получится вывернуться. Касательно 18 кератина - все правильно, там ведь не пишут, что он селективен...вот и результат. Вы вот говорите - с использованием моноклональных антител к М-клеткам. О каких антителах идет речь - о кератине том же, или другом. Есть ссылочка на статью? разместите - почитаю. Еще один совет - вы долго будете бродь на просторах Интернета и копаться в несметном количестве мусора. Проще связаться с представителями фирм производителей антител - те же микротесты или амтео или биовитрум (не сочтите за рекламу) - побеседуйте, вам все хорошо разъяснят. А пока тоже поищу - вдруг найду чего.
С уважением.
 
PavelДата: Понедельник, 2009-09-28, 2:25 PM | Сообщение # 3
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 30
Репутация: 0
Статус: Offline
Спасибо большое за ответ. Я имел в виду Антицитокератин 18. Его и предлагают использовать для М-клеток, хотя , как оказалось, он не селективен. Сейчас постараюсь ссылку на статью найти.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed....VDocSum

Further characterization of M cells in gut-associated lymphoid tissues of the chicken.Jeurissen SH, Wagenaar F, Janse EM.

Спасибо заранее

 
VladpathologДата: Понедельник, 2009-09-28, 3:32 PM | Сообщение # 4
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
не уверен - гляньте здесь:
ПЕРЕЙТИ
А как вы преодолеете тот факт, что большинство антител, выпускающихся фирмами являются анти-человеческими?
Я имел много проблем в этой связи, помогая делать работу на кроликах.
Если будете заказывать специальный клон, то проще выйти сразу на разработчиков антител - они и по селективности помогут.
 
PavelДата: Среда, 2009-09-30, 12:55 PM | Сообщение # 5
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 30
Репутация: 0
Статус: Offline
Но я нашел анти-куриные моноклональные антитела на сайте фирмы Southern Biotechnology/. Спасибо, статью просмотрел, но сложно приобрести моноклоны, да и с обработкой гистосрезов следует повозиться. В нашей лаборатории мы еще с таким не сталкивались. Но посижу еще со статьей.
Спасибо большое,
Павел
 
AnitraДата: Четверг, 2011-07-21, 0:29 AM | Сообщение # 6
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Репутация: 2
Статус: Offline
На тему протокола:
двойное окрашивание возможно если у антител разный паттерн окраски.
Например Эстроген и Her-2 можно вместе красить, тк один ядерный а второй мембранный.
Исходя из этой логики нужно посмотреть в каких сочетаниях можно красить ваши антитела.

О системе детекции.
Есть на рынке готовые системы типа как в BioCare на двойную окраску.
Но, ИМХО, при наличии рук и головы можно скомпелировать протокол из двух обычных систем - Даб и ФастРед. Аля:
1.Депарафинизация
2.Демаскировка
3.Инкубация ат1
4.Визуализация Даб
5.Инкубация с ат2
6.Визуализация ФастРед
7.заключение

Отмечу, что красную систему лучше использовать для ядерных маркеров, тк сигнал получается немного диффузней чем окраска Дабом и если красить ей мембраны, то получается не очень.
Если не ошибаюсь, среда для заключения дб на водной основе и-за чувствительности красной системы.
Сама не пробовала, но видела как это делают на Вентане - именно так.

Добавлено (2011-07-21, 0:29 Am)
---------------------------------------------
Со LSAB детекцией думаю получится дольше и немного хуже. Но почему бы и нет? Надо попробовать


Червяк длинный, а жизнь короткая
 
MaximДата: Четверг, 2011-07-21, 6:33 AM | Сообщение # 7
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
В отношении множественных окрасок была выпущена интересная книга: С.M. мan der Loos. Immunoenzyme Multilpie Staining Methods, 1999. Здесь подробно обсуждаются все нюансы.
Она сободно доступна здесь: http://free-books.dontexist.com/get?nam....6DE2E1D
Проверял сегодня.
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Double immunostaining method
Страница 1 из 11
Поиск: