фиксация мозга крысы - Форум
 
фиксация мозга крысы - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2016-12-09, 6:52 AM

Страница 1 из 11
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » фиксация мозга крысы
фиксация мозга крысы
ShelllДата: Понедельник, 2010-09-20, 4:24 PM | Сообщение # 1
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Репутация: 0
Статус: Offline
здравствуйте,
я новичок в гистохимии и мне очень нужен ваш профессиональный совет.
в протоколе окраски иммуногистохимии было написано, что требуется специальная фиксация,
в буфере 7.4 растворяют 1% параформа , L-лизин и периодат натрия.
я провела перфузию. заморозка проводилась жидким азотом и в криостате.
ткань получилась отвратительная...такое ощущение, что клетки расплавлены.....
у меня есть два предположения, почему так вышло: либо виноват периодат калия (который мне дали вместо периодата натрия. и сказали ,что разницы нет, т.к. количество его мизерно в фиксирующем растворе (менее 1 процента)), либо при такой слабой фиксации нужно быть предельно аккуратным при окраске, т.к. ткань становится более чувствительной к агрессивным реагентам...либо заморозка...что на мой взгляд мало вероятно...но ткань вообще никакая...смотреть не на что (((((
помогите пожалуйста советом, если кто попадал в такую же ситуацию или догадывается о причине...и не ругайте за непрофессионализм...я студентка и всему пока учусь на своих ошибках, т.к. посоветоваться не с кем...
заранее спаcибо


Сообщение отредактировал Shelll - Понедельник, 2010-09-20, 7:00 PM
 
VladpathologДата: Вторник, 2010-09-21, 6:15 PM | Сообщение # 2
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Посмотрите здесь
с какими антителами вы работаете? Почему предпочли криостатные срезы? Головной мозг на криостате ни разу не делал, думаю даже не стал бы и рисковать. По поводу приготовления забуференного формалина на сайте уже писали, где-то в разделе методик проводки материала. Вообще по опыту - забуференный формалин важно, но часто не критично (Ох сейчас набросятся коллеги biggrin ).
Еще здесь посмотрите.
С уважением.
 
ShelllДата: Вторник, 2010-09-21, 6:27 PM | Сообщение # 3
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Репутация: 0
Статус: Offline
Спасибо за ответ)))))
я работаю в научной лаборатории нейрофизиологии...здесь все делают срезы на криостате...как иначе я,ввиду отсутствия опыта, даже и не представляю..работаю с GAD 67 и 65. дело в том, что ранее делали все на 4% формалине и не было проблем...а с переменой фиксации выползла вот такая вот беда..поэтому я на фиксацию и грешу. но в протоколе к антителам рекомендуют именно 1%й формалин с вышеуказанными добавлениями....
кстати говоря, проводила сравнение...антитела с мозгами на 4% формалине и на том, что в протоколе...в первом случае - ткань хорошая,но не прокрасились антитела, а во втором, они отлично все прокрасили, даже без дополнительной проводки через гематоксилин было видно, но ткань УЖАСНА cry
так что продолжаю эксперементировать))


Сообщение отредактировал Shelll - Вторник, 2010-09-21, 6:29 PM
 
MaximДата: Вторник, 2010-09-21, 8:06 PM | Сообщение # 4
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемая Shelll!
Поясните, поажлуйста, какая фирма рекомендует такой проктокол для фиксации и затем исследования этого антитела на криостатных срезах?
Например, Abcam тоже дает много всяких рекомендаций, и там есть детальные протколы и пошаговые инструкции:
http://www.abcam.com/GAD65-GAD67-antibody-ab49832.html
Да и на сдругих сайтах полно рекомендаций по работе с этим антителом на тканях мыши, но для FFPE (фиксированных формалином и залитых в парафин) срезов. Например, www.ihcworld.com и ww.immunoportal.com можно покопаться.
И даже просто в поисковике google, набирая rat brain fixation или что-то похожее выпадает куча всяких протоколов.
Более конкретную информацию лучше искать здесь: http://www.histosearch.com/histonet.html
Как правило, здесь находятся похожие ответы. Я этот сайт читаю с 2004 года и нашел там ответы на большинство своих вопросов. Если конкретный вопрос не найдется, то читая подобные ответы, Вы сможете обратиться напрямую к людям, занимающимся нужной Вам проблемой. Как правило, они в советах не отказывают и охотно делятся ссылками и даже присылают статьи. Я видел в histonet не однажды ответы о фиксации мозга крыс и заморозке для ИГХ, но эти вопросы меня не интересовали, поэтому в моих файлах ничего для Вас найти, к сожалению, не могу.
А про фиксатоор с параформальдегидом, L-лизином и периодатом никогда не слышал. Дайте, пожалуйста, ссылку, просто любопытно узнать, чем еще пользуются люди.
 
ShelllДата: Вторник, 2010-09-21, 8:19 PM | Сообщение # 5
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Репутация: 0
Статус: Offline
Спасибо за ответ!
не ожидала, что так скоро откликнутся...посмотрю по ссылкам,которые Вы дали.
а вот ссылка на мои антитела и там же протокол к ним
http://www.millipore.com/catalogue/item/mab351

Добавлено (2010-09-21, 8:19 PM)
---------------------------------------------
я выбрала именно этот протокол, поскольку он приложен к антителам, которые я покупала...именно те, на которые я дала ссылку, фирма millipore

 
MaximДата: Вторник, 2010-09-21, 9:04 PM | Сообщение # 6
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Спасибо за ссылку, интересно. По-видимому, в данном случае для фиксатора критичен анион (периодат), а не катино (натрий или калий).
Еще в 2008 или 2009 году (точно не помню) в Journal of Histotechnology выходи специальный выпуск, посвященный нейрогистологии. Я не уверен, что в этом номере что-то нужное Вам имеется, но здесь http://www.nsh.org/content/archives есть архивы статей и номеров в pdf-формате за все годы.
А вот как добыть нужные статьи - нужно просто подписаться на histonet digest, и там задать свой вопрос. Вся сложность только в одном - все там на английском. Если с этим проблем нет - добро пожаловать. Я видел только 2 человек из России, которые задавали в нем вопросы, а сколько читают его не знаю. (Эта рекомендация Вам пригодится, если собираетесь серьезно работать в гистологии).
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » фиксация мозга крысы
Страница 1 из 11
Поиск: