Известно, что антитела распознают эпитопы преиму щественно в стереоструктуре, изменение которой под действием фиксаторов резко снижает антигенные свойства белков. При определенных условиях трехмерную структуру белка можно восстановить. Таков, как полагают, механизм воздействия микроволн на ткани, фикси рованные формалином. Напротив, антигены тканей, фиксированных другими фиксаторами, при МВО могут разрушаться. Формалин как бы "предохраняет" эпитопы от воздействия высоких температур, и использование микроволн значительно расширяет возможности иммуногистохимичсской диагностики. Эта концепция получи ла название "модификации — ремодификации". J Morgan и соавт. [4] предположили, что под действием формалина образуется комплекс белка с кальцием и требуется значи тельная энергия (сильное нагревание/микроволны) или реакция специфического связывания кальция (цитратный буфер), чтобы его разрушить.

Для получения хороших результатов в режиме МВО необходимо соблюдать следующие условия: 1) использовать адекватные фиксаторы и соблюдать оптимальные сроки фиксации; 2) применять специально обработанные стекла и тонкие срезы; 3) использовать деионизированную, а не обычную дистиллированную воду; 4) проводить обработку в микроволновом режиме по стандартной схеме.

1. Фиксация. Проблема фиксации для ИГХ является одной из ключевых, так как от нее в значительной степени зависят результаты реакции и именно этот этап менее всего поддается контролю, особенно при использовании блоков из архива. Тем не менее необходимо помнить следующие правила, которым нужно следовать при фик сации материала, предназначенного для иммуногистохимического исследования: а) использование в качестве фиксатора 10% нейтрального забуференного формалина позволяет с помощью МВО восстановить антигенную специфичность тканей (об этом свидетельствует и наш опыт). Нейтральный рН достигается при помощи фосфатного или трис-буфера. Срок фиксации не более 72 ч, оптимально 5—24 ч (в зависимости от величины объектов); б) очень хороший фиксатор — цинксодержащий формалин. Он не требует нейтрального буфера, обеспечивает хорошую сохранность структур ткани без их отвердения, позволяет выделить детали ядер и оказывает усиливающее действие на многие иммунные окрашивающие субстраты. Готовится на 10% формалине. Время фиксации 2—15 ч; в) другие фиксаторы — растворы Буэна, Карнуа — могут быть использованы для выявления не всех антигенов (по нашему опыту, раствор Буэна пригоден для МВО, а для выявления, например, р53 даже лучше формалина); г) спиртсодержащие фиксаторы, в частности жидкость Карнуа, для МВО многими не рекомендуются, так как не увеличивают чувствительность реакции [2, 5]. Наши данные это полностью подтвердили.

2 Обработка стекол. Без специальной обработки стекол нельзя получить хорошее качество препаратов, особенно при использовании МВО, специфика которой состоит в том, что раствор с помещенными в него стеклами должен определенное время кипеть. Поэтому, если срезы плохо закреплены, они повреждаются или отрываются от стекол. Чтобы этого избежать, надо пользоваться специально обработанными стеклами, например такими: 1) DAKO Silanized Slides, код No. S 3003; 2) Super Frost·/ Plus Slides (Menzel-Glaser, USA); 3) стеклами, покрытыми 0,1% poly-L-lysin (полилизином). Первые два пункта относятся к готовым фирменным стеклам, изготовленным специально для ИГХ. Однако можно самим приготовить стекла, используя, в частности, poly-L-lysine, который производится в твердом виде или в растворе. Стекла обрабатывают по следующей методике: чистые, желательно новые, без дефектов (царапин, неровностей) обезжиренные стекла хранят до использования в солянокислом спирте или кислоте, перед использованием их протирают (или отмывают от кислоты) и погружают в 0,1% раствор полилизина на 5—10 мин при комнатной температуре (мы пользовались 1% раствором фирмы "Sigma", из него готовили 0,1% раствор, который хранился до 3 мес при 4°С), затем жидкости со стекол дают стечь в раствор и, не вытирая, оставляют сушить в горизонтальном положении 60 мин при 5б°С или 24 ч при комнатной температуре.

3. Приготовление срезов. Срезы толщиной 4—5 мкм из ванночки с теплой дистиллированной водой помещают на стекла сразу всей поверхностью. Из воды стекла вынимают вертикально, иначе в срезах остаются пузыри воды, что резко ухудшает качество препаратов. Срезы расправляют при слабом нагревании, сушат в вертикальном положении при комнатной температуре и хранят несколько дней при 37°С.

4. Буферы. Все буферы готовят на деионизированной воде из готовых фирменных таблеток, концентратов или из соответствующих компонентов. Обычно применяют фосфатный (PBS) и трис-буферы (TBS) рН 7,4—7,6. Для МВО часто используют цитратный буфер рН 6,0. Если нет специальных указаний, можно заменять TBS на PBS и наоборот, но обязательно выдерживая рН раствора.

5. Метод МВО срезов. При одинаковых объеме и интенсивности микроволнового облучения до нужной температуры жидкости нагреваются с разной скоростью. Так, цитратный буфер чаще предпочтительнее деионизированной воды, так как в нем время действия микроволн можно сократить, а это уменьшает вероятность артефактов. Ряд факторов, из которых важнейший — температура раствора, влияет на восстановление антигенов. Установлено, что оптимальна температура, равная 100°С, что позволяет сократить время облучения. Однако часть поверхностных термолабильных антигенов при этом денатурируется, поэтому, прежде чем использовать МВО, следует уточнить их физико-химические характеристики. Для большинства антигенов в качестве раствора можно использовать деионизированную воду, для остальных оптимальные результаты достигаются в буферах с фиксированным рН. Иногда, особенно при фиксации более 1 года, требуются растворы с очень низкими значениями рН, даже менее 2,0 [б]. Чтобы избежать фонового окрашивания, следует сначала провести "калибровку" в растворах с разными рН. Доказано, что рН раствора гораздо важнее, чем его химический состав, поэтому сейчас отказались от таких растворов, в состав которых входят соли тяжелых металлов (свинец, цинк), так как цитратный, трис- и глицин-НС1-буферы, растворы мочевины и некоторые другие существенно их превосходят [б]. Другой важный фактор — концентрация первичных антител, так как, если она слишком высокая, это может приводить к резкому усилению фона. Следует прежде всего подобрать разведение, выбрав оптимальное для данного микроволнового режима, чтобы специфическое окрашивание было интенсивным, а фоновое — минимальным.

Процедура МВО. Препараты в специальных пластиковых емкостях погружают в раствор (деионизированную воду, цитратный буфер рН 6,0 или др.). Хорошо зарекомендовали себя, например, Plastic Spill-Free Slaide Jar емкостью 10 стекол, а также Plastic Staining Dish емкостью 25 стекол (фирма "LabMetod", Москва). Если нет возможности их приобрести, можно использовать полиэтиленовые, стеклянные или другие термостойкие емкости, кроме металлических. При размещении стекол в микроволновой печи желательно чтобы: а) емкости закрывались, ограничивая .вытекание жидкости (но не плотно, чтобы их не разорвало); б) раствор обязательно покрывал срезы, иначе ткань необратимо повреждается. Хорошие результаты дает установка в печи еще одной, большей, емкости, в которой раствор не кипит, но близок к кипению, что не дает интенсивно испаряться раствору со срезами; в) расстояние между стеклами было не менее 2—4 мм — для свободного движения пузырей воздуха в жидкости; г) емкости располагались так, чтобы пузыри кипящей жидкости ударялись в тыльную сторону стекла.

Описаны различные модификации метода МВО [1— б]. Апробировав несколько режимов, мы остановились на методике Sh.-R. Shi и соавт. [5], внеся в нее некоторые изменения. Мы убедились, что использование этого метода действительно позволяет увеличить чувствительность и улучшить качество реакции с большинством маркеров широкого спектра (хромогранином А, синаптофизином, нейроспецифической энояазой, виментином, цитокератинами, СЕА, EMA, LEA), S-100, PCNA, р53, р21, bcl-2, CD31, CD34, серотонином и, что особенно важно, избежать ложноотрицательных результатов, обусловленных фиксацией. Напротив, по нашему опыту, для большинства гормонов, а также интерлейкинов микроволновое облучение не требуется; так как интенсивность реакции снижается, лучше применять трипсин или вообще не обрабатывать срезы. Ниже приводится примерный протокол, несколько лет успешно применяемый нами при иммуногистохимических исследованиях. Мы используем только хорошо зарекомендовавшие себя антитела (фирм "Dako", "Immunon", "Sigma" и др.). Если нужно ускорить исследование, удобны антитела в рабочих разведениях и наборы фирмы "Immunon" ("LabMetod").

Протокол иммуногистохимического исследования с МВО тканевых срезов

1. Срезы депарафинируют по стандартной схеме. 2. Обрабатывают 5 мин 3% Н^О; для блокирования эндогенной пероксидазы. 3. Промывают в дистиллированной воде 5 мин. 4. Препараты погружают до верхнего среза в деионизированную воду или цитратный буфер и помещают в микроволновую печь. 5. Устанавливают мощность 650—750 Вт (мы используем печь фирмы "DAEWOO" KOR-102M, 2,45 МГц, которая позволяет выбрать режим мощности 690 Вт). 6. Устанавливают время обработки — 2 раза по 5 мин с интервалом между циклами 1—2 мин, чтобы раствор перестал кипеть, и при необходимости добавляют раствор (считается, что нужный эффект получают, воздействуя микроволнами не менее 140 с от начала кипения). 7. После окончания обработки препараты остывают в растворе при комнатной температуре не менее 15—20 мин. 8. Стекла споласкивают в 2 порциях дистиллированной воды, затем 5 мин в буфере.

Далее реакция проводится в соответствии со стандартным протоколом. Если проводилась МВО, то пищеварительные энзимы не применяют. В нашей модификации мы часто используем большие разведения антител и пролонгируем время инкубации с ними — срезы с нанесенными первичными антителами находятся во влажной камере 20 мин при комнатной температуре, затем 15—18 ч при 4°С. Это увеличивает интенсивность реакции, особенно при использовании таких чувствительных к фиксации антител, как PCNA, MIB-1, р53, bcl-2 и некоторых других.

Использование микроволновых печей. Для МВО гистологического материала сейчас выпускаются специальные печи, но можно воспользоваться и обычными бытовыми СВЧ-печами, если они имеют нужный интервал мощности — 650—900 Вт. Пользуясь методикой, описанной в научной публикации и выполненной с применением микроволн, следует понимать, что точное ее воспроизведение возможно только при использовании печи той же модели. В целом надо признать, что в настоящее время каждая лаборатория имеет свои собственные параметры МВО, отработанные экспериментально на собственном оборудовании, и они могут быть использованы в других условиях только как ориентировочные. Поэтому лучше всего пользоваться специальными микроволновыми печами, позволяющими программировать любой режим, в том числе ускорять иммуногистохимическую реакцию. Известно, что оптимальным является взаимодействие первичных антител с антигенами в течение 24 ч при 4°С. Этого времени обычно достаточно, чтобы антитела диффундировали в образец и произошло специфическое связывание. Однако если антигена мало, этого может оказаться недостаточно, в то же время воздействие микроволн в течение 2—3 мин при температуре 37°С существенно улучшает их диффузию и дает прекрасные результаты. Но приведенный метод можно использовать только в специализированных печах, имеющих датчик температуры, например таких, как 193-MICROWAVE" (800 Вт), поставляемых фирмой "LabMetod". Если же температура не регулируется, связь антитела с антигеном может разрушаться, что приведет к обратным результатам. Если необходимо провести иммуногистохимическую реакцию в тот же день, когда получен материал, нужно использовать технику криостатных срезов, исключив длительный процесс фиксации, проводки и заливки. Реакция проводится аналогично, но с антителами, которые можно использовать на замороженных срезах. Очень перспективными при наличии специальной аппаратуры, в частности центрифуги "Cytospin", являются иммуногистохимические исследования монослойных цитологических препаратов.

В заключение следует еще раз подчеркнуть: первое, что необходимо сделать для успешного иммуногистохимического исследования с использованием МВО, — это провести пробную реакцию с различными разведениями первичных антител, сроками инкубации и режимами воздействия микроволн, что позволит отработать оптимальный режим; второе — по возможности обеспечить стандартизацию всех остальных этапов реакции, включая использование стандартных антител и реактивов.

ЛИТЕРАТУРА
1. Сатрат D., Cecchetti D., Bevilacqua G. // J. Path. — 1993.-Vol. 171. - P. 151-152.

2. Fisher С. J., Gillet С. Е., Vojtesek В. et al. // Brit. J. Cancer. - 1994. - Vol. 69. - P. 26-31.

3. Haersley Т., Jacobsen G. К. f/ Acta path. microbiol. immunol. scand. — 1994. — Vol. 102. —P. 395—400.

4. Morgan J., Navabi H., Schimid K. W., Jasani В. // J. Path. - 1994. — Vol. 174. — P. 301—307.

5. Shi Sh.-R., Key M. Е., Kaira K. L. // J. Histochem. Cytochem. - 1991. - Vol. 39. - P. 741-748.

6. Shi Sh.-R., Cote R. J., Taylor C. R. // Ibid. - 1997. -Vol. 45, N 3. - P. 327-343.

Поступила в редакцию 02.03.98

THE TECHNIQUE OF RECOVERY OF ANTIGENIC SPEC1FICITY BY MICROWAVES GENERATION ON THE TISSUES FIXED BY FORMALIN AND PARAFFIN-IMPREGNATED IN IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES

L. Е. Gurevich, V. A. Isakov

M. F. Vladimirsky Research Clinical Institute of the Moscow Region, 129110 Moscow

Summary — Recovery of specific antigenic characteristics using microwave treatment of paraffin sections of tissues fixed by formalin allows to extend spectrum of antibodies for immunohistochemical diagnosis. Miscrowaves enable the reaction on the material prepared according to the standard technique, and macropreparations long storaged in formalin and archive blocks.

Arkh.Patol., 1999, N 2, P. 48-50.