Неспецифическое окрашивание гистопрепаратов

Pavel

Дата: Четверг, 2009-12-17, 9:47 PM | Сообщение # 1

Лейтенант

Группа: Проверенные

Сообщений: 30

Репутация: 0

Статус: Offline

Уважаемые коллеги, помогите, пожалуйста советом. Для диагностики инфекционной болезни птиц мы применили способ детекции антигена в срезах ткани на основе иммуногистохимической реакции. Первичные антитела получили путем гипериммунизации кроликов, вторичные антитела купили в виде коммерческого реагента. Визуализировали ДАБом. Антиген вроде проявился, но вся сложность, что и в контрольном препарате оказалась неспецифическое окрашивание. Как можно избежать неспецифической окраски тканей? Можно ли избежать дорогих коммерческих блокирующих растворов.
Спасибо заранее, Павел

Patologoanatom

Дата: Пятница, 2009-12-18, 7:51 AM | Сообщение # 2

___

Группа: Администраторы

Сообщений: 755

Репутация: 11

Статус: Offline

Уважаемый Pavel,
Если под неспецифическим окрашиванием Вы подразумеваете фоновое окрашивание, то попробуйте предпринять процедуры по устранению фона. Обсуждалось в разделе: Способы устранения фонового окрашивания. Для оптимизации разведения первичных и вторичных антител используйте методику - checkerboard titration.

Quote (Pavel)

Для диагностики инфекционной болезни птиц мы применили способ детекции антигена в срезах ткани на основе иммуногистохимической реакции. Первичные антитела получили путем гипериммунизации кроликов, вторичные антитела купили в виде коммерческого реагента.

Сложно это все разложить по полочкам: ткань от одного животного, иммунизация другого, система детекции неизвестно какая, (перекрестная реакция и.т.д.). Материал замороженный или FFPE?

Quote (Pavel)

Антиген вроде проявился, но вся сложность, что и в контрольном препарате оказалась неспецифическое окрашивание.

Контроль негативный или позитивный?
Сфотографируйте и покажите микропрепараты, тогда проще будет понять о чем идет речь.

Pavel

Дата: Пятница, 2009-12-18, 6:17 PM | Сообщение # 3

Лейтенант

Группа: Проверенные

Сообщений: 30

Репутация: 0

Статус: Offline

Уважаемый Patologoanatom. Мы не использовали никакой системы детекции вирусного антигена. только первичное антитело, вторичное антитело и ДАБ. Хотя в лаборатории есть система для LSAB, которую мы используем для выявления клеточных субпопуляций. Почему ткань одна, а гипериммунизация других животных? Как мне объясняли в Германии если первичные антитела для птицы, то вторичные должны быть получены от другого вида животных, в данном случае от кролика.

Мы проводили отрицательный контроль антигена. Получили и в контроле и в инфекционном материале коричневые конгломераты. Я так понял, что большой уровень неспецифического окрашивания. Сейчас подготовлю фотографии и вышлю.
Спасибо.

Добавлено (2009-12-18, 9:48 Am)
---------------------------------------------
Кусочки органов фиксированы в формалине.

Добавлено (2009-12-18, 10:00 Am)
---------------------------------------------
Под неспецифическим окрашиванием понимаю эндогенную пероксидазную активность

Добавлено (2009-12-18, 10:22 Am)
---------------------------------------------
У меня не получается прикрепить здесь фотографии. Вы могли бы дать мне адрес электронной почты?

Добавлено (2009-12-18, 6:17 Pm)
---------------------------------------------
Подскажите, пожалуйста, где найти методику checkerboard titration.

Patologoanatom

Дата: Пятница, 2009-12-18, 10:44 PM | Сообщение # 4

___

Группа: Администраторы

Сообщений: 755

Репутация: 11

Статус: Offline

Pavel, проконсультируйтесь еще раз с производителями антител.
Оптимизируйте методику. Отрицательный контроль (стекло на котором не инкубировали первичное антитело, а только PBS или IgG) должен быть негативным. Выясняйте, что за конгломераты: формалиновый пигмент, преципитат DAB?
Положительный контроль должен быть позитивным. Оптимизируйте разведение. Ограничьтесь серийными разведениями.

Quote (Pavel)

Подскажите, пожалуйста, где найти методику checkerboard titration.

В гугле.
Фотографии можете в фотогалерею загрузить, хотя можно и без них обойтись.