Постановка ИГХ-методики. - Форум
 
Постановка ИГХ-методики. - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2016-12-09, 6:47 AM

Страница 1 из 11
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Постановка ИГХ-методики. (Прошу помощи.)
Постановка ИГХ-методики.
NymrutДата: Суббота, 2013-04-13, 12:38 PM | Сообщение # 1
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 7
Репутация: 0
Статус: Offline
Здравствуйте, уважаемые участники форума.
Являясь лаборантом морфологической лаборатории в медицинском НИИ, последние несколько недель занимаюсь постановкой ИГХ (цели исследовательские, не диагностика). По специальности - биохимик.
Не нахожу результаты удовлетворительными.

Пробую параллельно несколько антител, фирмы Novocastra и Dako. Система визуализации полимерная, Novocastra.
Сейчас работаю с серотонином, Ki67, триптазой тучных клеток, тяжёлой цепью миозина (точно назвать клон и производителя каждого антитела смогу позднее). Ткань - слизистая из различных отделов ЖКТ.

Претензии к получаемым результатам:

Серотонин - слабое специфическое или полное отсутствие какого-либо окрашивания на отдельных стёклах, странная неспецифика (окрашены некоторые ядра).
Ki67, готовый к использованию, с рекомендованной 15 мин. экспозицией при комнат. t, не красит ни после 30-, ни после 30 мин. при 37 гр. Хорошее окрашивание даёт ночная экспозиция в холодильнике, но по каким-то причинам не на всех стёклах, хотя пролиферативная активность так или иначе должна присутствовать везде.
Триптаза тучных клеток даёт сильную неспецифику в стромальном компонента. На форуме прочёл, что при сильной инфильтрации иммун. клетками это ожидаемо. Использовался разбавитель Дако с функцией снижения неспецифич. окраски. Однако только очень высокие разведения (1:500) позволили получить низкий уровень неспецифики, но и специфическое окрашивание стало слабым. То есть неудовлетворительное соотношение сигнал/шум.
Миозин, готовый к использованию, даёт едва ли не более сильное окрашивание, чем триптаза тучных клеток. С чем это может быть связано? Возможно, с избыточной чувствительностью системы детекции? Рекомендовано ли разбавлять предуготовленные антитела?

Также есть проблема с парафином. Его остаётся много на отдельных препаратах, при том, что другие стёкла из партии вполне удовлетворительно отмываются. Проводка в трёх ванночках с толуолом по 7-10 мин., затем три смены спирта. Как это можно исправить?

Усреднённый протокол (пробовал различные варианты, но в данный момент пока наиболее устоявшийся):

Демаскировка в Таргете (10X S1699), 40 мин. в водяной бане (свободной микроволновки или рисоварки нет), затем 40 мин. экспозиции в термостате при 60 гр. (совет старшего коллеги).
Пероксидазный блок:10мин. (негатив. контроль с ДАБом без антител чистый).
Протеиновый блок: от 5 мин. (для антител, дающих слабое окрашивание - серотонин, Ki) до 20 мин. (для антител, стабильно дающих сильную неспецифику - триптаза).
Экспозиция с первичными антителами: 30 мин./ ночь в холодильнике
Постпримари блок: 20 мин.
Вторичные антитела: 30 мин. (негативный контроль без первичных антител чистый).
ДАБ.

Отмывка в TBS.

Относительно контроля. Не представляю, что можно было бы использовать в качестве такового. НИИ специализированное гастроэнтерологическое. Активности, специфичные к перечисленным антителам, должны встречаться во всех препаратах слизистой. Единственная идея - использовать в качестве негативного контроля в отдельных случаях биоптаты печени (в каких именно - не могу предложить, не ознакомлен детально с её гистологической структурой, полагаю, как минимум, для серотонина).

С уважением; не будучи, строго говоря, вашим коллегой, рассчитываю на ваше желание поделиться мастерством.


Сообщение отредактировал Nymrut - Вторник, 2013-04-16, 8:46 PM
 
MaximДата: Воскресенье, 2013-04-14, 11:04 PM | Сообщение # 2
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Nymrut!
Все, что описано Вами, мне навевает только один вопрос: с подготовкой образца до этапа ИГХ-исследования все в порядке?
Уж если Ki67 не красит - точно фиксация негодная.
Поделитесь, в чем, сколько, какой толщины кусочек фиксируете и как быстро он попадает в фиксатор?
Остальные этапы тоже важно соблюсти правильно, но это второй вопрос.
 
NymrutДата: Среда, 2013-04-17, 12:30 PM | Сообщение # 3
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 7
Репутация: 0
Статус: Offline
Цитата (Maxim)
Все, что описано Вами, мне навевает только один вопрос: с подготовкой образца до этапа ИГХ-исследования все в порядке?


С соблюдением условий фиксации действительно есть затруднения.
Биоптаты толщиной в среднем 1-2,5 мм фиксируются в 10% забуференном формалине, насколько я знаю, сразу после биопсии. Обычно время фиксации составляет 24-72 ч., но материала поступает много, и в отдельных (худших) случаях может составлять около 110 часов.
Затем  проводка: ацетон 2 по 40 мин., толуол 20 мин., термостат с тремя сменами парафина при 60 гр.

Я должен скорректировать информацию по качеству окрашивания. По прошествии 3 суток после заключения оно изменилось.
Серотонин получился полностью, причём никакой неспецифики теперь я не обнаружил.
Триптаза тучных клеток (Дако, клон АА1) также дала чёткое окрашивание, хотя и несколько слабое там, где отсутствует фон. Но похоже, кроме тучных клеток выборочно  окрасились и др. структуры: контуры сосудов и что-то, что мы не можем распознать (вероятно, элементы матрикса).
О Ki67 (Новокастра, ММ1) не могу сказать ничего нового, кроме того, что действительно не могу быть уверен в соблюдении оптимальных условий фиксации для той партии стёкол, на которых окраска получилась через одно даже после ночной экспозиции - то были архивные материалы.

Меня продолжает беспокоить ситуация с миозином (Dako, SMMS-1). Это антитела FLEX (Link), что, как я понял, означает, что они предназначены для автоматизированной процедуры с использованием соответствующей линии оборудования. И всё-таки, возможно добиться успеха с ними, работая вручную?

Не могли бы вы ещё поделится мыслями по поводу парафиновых осадков и контроля?

Благодарю Вас.


Сообщение отредактировал Nymrut - Среда, 2013-04-17, 7:29 PM
 
MaximДата: Четверг, 2013-04-18, 9:44 PM | Сообщение # 4
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Nymrut!
Да, длительное хранение в 10% формалине ухудшает ИГХ окраску многих маркеров. Поэтому все должно быть оптимально фиксировано. Храните ваши ткани в 70% этаноле иили изопропаноле - все будет ок.

Flex разработан для стейнера, но я работаю с этой системой уже второй год руками и все ок. Уверен, что и другие люди тоже так делают, у кого нет сайнера, а ИГХ есть.

А что с парафиновыми осадками и контроля?ми (не понял вопроса).
 
NymrutДата: Понедельник, 2013-04-22, 10:03 AM | Сообщение # 5
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 7
Репутация: 0
Статус: Offline
Уважаемый Maxim! Спасибо за внимание к моим вопросам.
Я правильно понимаю, что можно использовать спирты в обычном, не забуференном, растворе?
Используете ли вы методику пошаговых разбавлений, работая с flex?
 
Последний мой вопрос - это отсылка к моему стартовому сообщению. Позволю себе процитировать:
 
"Также есть проблема с парафином. Его остаётся много на отдельных препаратах, при том, что другие стёкла из партии вполне удовлетворительно отмываются. Проводка в трёх ванночках с толуолом по 7-10 мин., затем три смены спирта. Как это можно исправить?"

"Не представляю, что можно было бы использовать в качестве контроля. НИИ специализированное гастроэнтерологическое. Активности, специфичные к перечисленным антителам, должны встречаться во всех препаратах слизистой. Единственная идея - использовать в качестве негативного контроля в отдельных случаях биоптаты печени (в каких именно - не могу предложить, не ознакомлен детально с её гистологической структурой, полагаю, как минимум, для серотонина)".
 
larisa_snurnicinaДата: Понедельник, 2013-04-22, 11:03 AM | Сообщение # 6
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Репутация: 0
Статус: Offline
Я, конечно, особо помочь не могу, т.к. у меня VENTANA, но на счет фиксации в формалине точно знаю, что нельзя фиксировать и проводить материал в кислом формалине. По литературным данным фиксация в кислом формалине, а тем более длительная, нарушает белковые связи и, соответсвенно, ухудшается реакция антиген-антитело. Мы фиксируем исключительно в забуференном формалине.
 
MaximДата: Понедельник, 2013-04-22, 9:18 PM | Сообщение # 7
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Nymrut!
Если речь идет о фиксаторе, то в нем не должно быть никаких спиртовых веществ, потому как формалин действует перекрестным связыванием белков, а спирт - коагуляцией (свертыванием) и поэтому часть поверхностных антигенов в спиртовой фиксации просто не работает. Формалиновые сшивки разрушаются на этапе демаскировки. Если ткани не фиксировать, то часть антигенов не сохранится, да саму ткань не удасться даже хорошо срезать.

Депарафинирование очень важный вопрос. Парафин - среда неполярная и в ней реакции, интересующие нас практически не идут. Мы удаляем парафин, запускаем реакции, останавливаем их, удаляя из препаратов воду и помещая в кслол, а потом и в заключающую среду. Для депарафинирования есть много веществ и разные способы. Толуол - не самое лучшее вещество. К тому же он еще и вреднее ксилола (очень не рекомендую травиться, особенно, если рядом есть беременные сотрудницы).

Если в лаборатории темпеартура ниже 20оС, то и ксилол и толуол нуждаются в подогреве хотя бы до 30-40оС. В холоде процесс растворения парафина сильно замедляется. Также нужно следить за своевременной сменой растворов.

Все структуры для контроля есть в слизистой желудка, эт точно. Ki67 хорошо виден в скоплениях лимфоидной ткани.

Демаскировка в водяной бане при 100оС 20 минут вплоне достаточна для Ki67 (если нет других специальных указаний в аннотаии к первичным антителам). Разведения нужно подобрать для концентратов, rtu работают 10-30 минут (если оговрено в интсрукции, то выполняют этап с линкером). Потом промывка и система детекции, ДАБ (это я про Dako). Зачем все эти блокады, не знаю.
Для ночной инкубации антиела должны быть разведены в 100 и более раз, чем обычно. Этим можно сэкономить  на расходе антител. но для начала я бы начал с rtu, затем при хороших результатах перешел на концентраты, и потом только игрался бы ночными разведениями. В практической работе в потоке нет времени на ночные инкубации. Днем-вечером резка, сушка до утра. С утра депарафинирование, демаскировка, ИГХ, докраска и к 12 часам первый запуск готов. Если получается, следом можно запустить еще один прогон, но он уже будет готов к 14-15 часам.
 
NymrutДата: Вторник, 2013-04-23, 2:24 PM | Сообщение # 8
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 7
Репутация: 0
Статус: Offline
Larisa snurnicina , спасибо за рекомендацию, только забуференный формалин мы и используем.

Maxim, спасибо Вам большое за ваши развёрнутые ответы! К сожалению, я, видимо, не всё до конца понимаю.
В частности, мне не ясно, как соотносятся эти две рекомендации:
 

Цитата Maxim

Цитата
Да, длительное хранение в 10% формалине ухудшает ИГХ окраску многих маркеров. Поэтому все должно быть оптимально фиксировано. Храните ваши ткани в 70% этаноле иили изопропаноле - все будет ок.


Цитата
Если речь идет о фиксаторе, то в нем не должно быть никаких спиртовых веществ, потому как формалин действует перекрестным связыванием белков, а спирт - коагуляцией (свертыванием) и поэтому часть поверхностных антигенов в спиртовой фиксации просто не работает.


 
 
Обязательно предложу коллегам заменить толуол на ксилол и попробую внедрить в проводку подогрев депарафинизирующего агента (температура действительно ниже 20оС).

Что касается контроля, то Вы, насколько я понял, имели ввиду положительный, мы же нуждаемся в отрицательном...
И, простите, что такое линкер? Речь же не о линкерной молекуле? У нас есть только полимерная система.


Сообщение отредактировал Nymrut - Вторник, 2013-04-23, 2:26 PM
 
MaximДата: Вторник, 2013-04-23, 10:01 PM | Сообщение # 9
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Nymrut,
Ксилол и толуол далеко друг от друга не ушли. Мы в своей лаборатории пользуемся уайт-спиритом много лет. Отлично все работает, но после должен быть либо ацетон, либо изопропанол. Мы пользуемся изопропанолом. Рекомендую.

Отрицательный контроль на самом деле штука не ахти какая важная. Кстати, в США уже размышляют усиленно о том, чтобы перестать ими пользоваться, поскольку их значиость была переоценена, и расход сил, средств и времени не оправдывает цель.
Реокмендации по + и - контролям также можно вычитать из вкладышей к антителам. Как только у Вас хорошо отработается метод, отрицательный контроль будет избыточен. Но не хороните положитеьный контроль! Это заблуждение.

Линкер - это связывающее антитело. Помомгает в связывании первичного антитела с системой детекции. Нужен далеко не во всех случаях. О нем написано в аанотации к системе детекции и есть в методических руководствах Dako, их можно скачать с их сайта.

Хранение в нейтральном формалине образцов свыше 72 часов не хорошая идея. Фиксация к этому времени вобщем считается зконченной, а перекрестные сшивки продолжают образовыаться и далее происходят внутримолекулярные переконфигурации белков, которые затрудняют восстановление молекул белка в состояние, пригодное для ИГХ-исслдеования. Для этого после 72 часов фиксации ткани и помещают в спирты и там можно их хранить долго. Это я имел в виду запасы, которые ионгда очень нужны. Разумеется, с вырезанными тканями работают сразу и никто их нигде не хранит.

Есть фиксаторы с формалином и спиртом, вариантов полно. Они хороши для разных целей, но не для ИГХ.
 
NymrutДата: Четверг, 2013-04-25, 9:08 AM | Сообщение # 10
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 7
Репутация: 0
Статус: Offline
Спасибо Вам большое ещё раз.
 
Правильно ли я понял, что после 24-72 часовой фиксации в формалине при последующем перемещении образцов  в спирт закрытия поверхностных антигенов уже не произойдёт вследствии образования перекрёстных сшивок?
 
MaximДата: Четверг, 2013-04-25, 9:11 AM | Сообщение # 11
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Да, именно так. Но если вырезанные кусочки не толще 3 мм.
 
NymrutДата: Четверг, 2013-05-16, 8:13 PM | Сообщение # 12
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 7
Репутация: 0
Статус: Offline
Не думаю, что стоит создавать новую тему, задам вопрос уважаемым участникам форума здесь:

  Возникла проблема с архивным материалом. Ki67 не окрашивает ядра, либо не на всех срезах, либо даже только на отдельных участках одного среза. Часто окрашивается цитоплазма, причём окрашивание выглядит специфичным и особенно заметно рядом с крупным неокрашенным ядром.
  Свежий материал красится совершенно чётко. Коллеги уверяют, что условия фиксации не менялись, напротив, раньше время фиксации в парафине было часто ближе к 24 часам.
  ИГХ-реакция на том же материале с другими антителами вышла вполне удовлетворительно.

  Надеюсь на ваши рекомендации.
 
MaximДата: Воскресенье, 2013-05-19, 12:36 PM | Сообщение # 13
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Длительное хранение архивного материала часто дает непредсказуемые и нечеткие результаты ИГХ-тестов (что-то работает, а что-то нет). Поэтому желательно архвиный материал  хранить либо в 70% изопропаноле либо 70% этаноле.
 
NymrutДата: Понедельник, 2013-05-20, 11:19 AM | Сообщение # 14
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 7
Репутация: 0
Статус: Offline
Уважаемый Maxim! Вы продолжаете просвещать начинающих лаборантов, спасибо Вам за это.
 
 Дело в том, что наш архив - это проведённый и заключённый в парафин материал. У нас считают, что такой способ хранения должен оптимально сохранять иммуногистохимические свойства исследуемой ткани. И положительные результаты в случае других антител заставляют думать, что это по крайней мере отчасти истинно. Но не в случае Ki67.
  Не ззнаю, можно ли в принципе что-то предпринять в подобном положении.
 
MaximДата: Понедельник, 2013-05-20, 9:44 PM | Сообщение # 15
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
По хранению блоков нет специальных особенностей.
Если Ki67 не получается ни в каких срезах, а другие тесты проходят на ура, то тут можно задуматься об антителе.
Если же оно вполне удовлетоврительно работает на любых других случаях - здесь точно проблема в фиксации. И если не в самом процессе, то в реактиве. Проверьте фиксатор или  возмите фиксатор из другой фирмы или заболтайте сами. ki-67 действительно не работает при проблемах с фиксацией. Этакий еще один негласный индикатор качества фиксации.
Пробуйте, все должно получиться.
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Постановка ИГХ-методики. (Прошу помощи.)
Страница 1 из 11
Поиск: