Гематоксилины - Страница 2 - Форум
 
Гематоксилины - Страница 2 - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2016-12-09, 12:45 PM

Страница 2 из 3«123»
Форум » ОПЕРАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ » Методики » Гематоксилины (вопрос выбора гематоксилинов)
Гематоксилины
MaximДата: Пятница, 2010-06-18, 11:38 PM | Сообщение # 16
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
А почему так упал на душу именно Gill?
В его состав в качестве растворителя входит вода и этиленгликоль.
А в состав Lillie вместо этиленгликоля входит глицерин. Эти вещества всего лишь замедляют испарение рабочего раствора и являются консервантами в некотором смысле.
Все остальное в эквивалентных количествах (гематоксилин, иодат натрия, квасцы, ледяная уксусная кислота).
Я именно из-за этиленгликоля и отказался от Gill. Не хочу еще одной гадости в лаборатории.
Залез в аннотации Биовитрум по гематоксилину. Там не сказано, что он содержит этиленгликоль. Это значит, что либо они умлочали об этом, либо там и правда нет этиленгликоля. Выводы делайте сами.
У производителя красители хорошо покупать тогда, когда нет времени это делать самим.
Я предпочитаю потратить 2 х 20 мин в месяц на приготовление красителя и работать с известными веществами,а не эзотерическими рецептами.
Разница в цене гематоксилинов должна быть вызвана разным количеством красителя (большей частью) и стоимостью растворителей и окислителей, если, конечно, производитель соблюдает точные прописи.

А красил разными гематоксилинами один и тот же лаборант? Все остальные этапы окраски не отличались? Может быть, стекла с Gill попали на свежие реактивы для депарафинирования?

Эти вопросы я задаю потому, что теоретически не должно быть существенной разницы между гематоксилинами, их действующие начала одинаковы. И если все сделано было верно и одинми руками, Вы должны были видеть абсолютно одинаковые картинки (разумеется, если срезы были из одного и того же блока и одной толщины). Если все же разница получается - лаборант где-то что-то не учел и не умеет хорошо управлять окраской или сознательно это скрывает.

Интересно, а на поверхности Gill пленка образуется через какое время эксплуатации?

У меня много фоток нет, и я не мастер фотографий, но вот нашел то, что готовил для своих презентаций.
Гематоксилин Lillie (собственного приготовления). Проводка с изопропанолом и минеральным маслом. Депарафинирование без ксилола (с фэйри). Фиксация 10% NBF, рутинный аутопсийный и биопсийный материал.
Никак не доберусь пофотографировать ИГХ. Собственного фотоаппарата на микроскопе нет.

В приложении еще один файл с настоящим составом для гематоксилинов Gill (I, II и III).

Прикрепления: 4160369.jpg(136Kb) · 8447323.jpg(106Kb) · _Gill.doc(34Kb)
 
RomanДата: Вторник, 2010-06-22, 9:39 PM | Сообщение # 17
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Уважаемый Maxim, спасибо за статьи по гематоксилинам, очень интересно, особенно о химизме реакций. Все мозги запудрились, но потом что-то прояснилось. Не совсем понял: гематоксилин не обладает сродством к кислым субстанциям, а совсем наоборот, и причина окрашивания клеточного ядра совсем в другом (связывание с катионными белками ядра и гидрофобными взаимодействиями с ДНК)?
И еще в материале Bryan Llewellyn - фраза "очень полезно поупражняться контролированию процесса окраски Г.-Э." - поясните, если можно, что имеется в виду: время окраски? длительность дифференцировки? или соотношение красителя, протравы и рН в краске?
Заранее спасибо.


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
MaximДата: Вторник, 2010-06-22, 11:45 PM | Сообщение # 18
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Roman!
Простейшее объяснение – это то, что гематоксилин реагирует как катион и притягивает анионы ткани, такие как фосфатные группы ДНК и карбоксильные группы белков (обычно ими богаты гистоны). Более полное – это то, что он притягивается как минимум к ДНК посредством ковалентных а также координационной связей. А алюминий это мост между анионным красителем гематеином и отрицательно заряженными фосфатными группами ядра. Строго говоря, гематоксилином мы выявляем в ядрах только фосфаты и гистоны. Если же интерсует только ДНК, лучше воспользоваться реакцией Фельгена с реактивом ШИффа.

Подразделение на «кислые » и «основные» красители в биологической окраске неверно с химической точки зрения. Например, отрицательно заряженный анион гематеина является не «кислым» красителем, а донором электронов по Bronsted-Lowry, и по Lewis анионным основанием. Положительно заряженный Al3+ является не основанием, а электроноакцепторной катионной кислотой Lewis.
Лично я думаю, что для практики такие химически дебри даже наносят больше вреда, чем понимания и лаборантам и патологам. Поэтому глубокую химию лучше оставить на растерзание химикам.

Что касается "упражнений в окраске" - это проба окрашивать разное время и дифференцировать разными агентами, а также проба разных рецептов гематоксилина (упражения по изменению состава лучше не проводить - получится слшиком много переменных для анализа и не будет ясно, какая из них ключевая).
"Прогрессивный" рецепт - без дифференцировки (Mayer) - сколько ни крась, перекраска не наступит и дифференцировка не нужна. "Регрессивный" (Gill, Harris, Lillie и др.) - если красить 1-2 минуты, может быть слабая окраска. Если 5-10 мин - обычно избыточная. Избыток удаляют кислым спиртом или водными растворами кислот (концентрации от 0.25% до 1%).
Я предпочитаю раз 10-15 макнуть стекло в 0.25% водную солянку и даже вернуться еще раз, если нужно (а не 1 раз в 1% солянокислый спирт). После дифференцировки нужно прополоснуть стекло несколькими маканиями в водопроводной воде и перенести в следующую порцию воды или в подсинивающий раствор - так гарантируется удаление избытка кислоты из среза (полностью реакция останавливается в неполярном ксилоле). Этапы дифференцировки и возврата к гематоксилину можно проводить многократно, пока не почувствтуется "оптимум". А когда этот оптимум получается с полоборота - лаборант приобретает класс. И ему не нужны часы, он может выдать любой результат по заказу. Это просто сделать с одиночными стеклами и очень трудно, если в одной партии срезы разной толщины. А еще избыток хлорки в воде может ослаблять окраску гематоксилином.

При окраске многих партий обычно в раствор красителя заносится вода (хуже, если это водопроводная вода). рН раствора начинает расти и раствор красит хуже. Добавка буквально нескольких капель ледяной уксусной кислоты мгновенно исправляет положение. Однако, разбавление все же происходит, и поэтому достаточно просто дать стечь лишней воде перед гематоксилином.

Таким образом, окраска одного стекла иллюстрирует теорию, а многих партий - практику.

 
ЧаконаДата: Среда, 2010-06-23, 2:18 AM | Сообщение # 19
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 105
Репутация: 5
Статус: Offline
Quote (Maxim)
Например, отрицательно заряженный анион гематеина является не «кислым» красителем, а донором электронов по Bronsted-Lowry, и по Lewis анионным основанием.


Погодите-погодите, а кто и где гематеин (сиречь гематоксилин) называл "кислым" красителем? По-моему, его всегда приводят в пример как классическую основную краску.

Добавлено (2010-06-23, 2:18 Am)
---------------------------------------------
Вообще же, мне не вполне понятно: может, у меня гематоксилин какой-то особенный, но мне странно слышать о необходимости как-то улучшать этот способ окраски. Не помню ни одного случая, чтобы я был недоволен качеством окраски - тут у нас всегда все превосходно. Неудачи с заливкой, редко - с фиксацией - да, были, но не с окраской гематоксилин-эозином, ШИК и по Ван-Гизону (методы, которые всегда хорошо идут даже у криворуких).

 
MaximДата: Среда, 2010-06-23, 8:30 AM | Сообщение # 20
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Чакона!
Поажлуйста, не путайте гематоксилин (слабо заряженный отрицательный порошкообразный краситель) и гематеин - лак (комплекс гематоксилин + протрава).

Цитата из Ромейс (1953).:
648. Гематоксилин представляет собой краситель, имеющий лишь слабый отрицательный заряд. При переходе в продукты окисления, гематеин и оксигематеин, отрицательный заряд возрастает. Изоэлектрическая точка гематеина лежит при рН 6.5. При образовании лака под влиянием таких электролитов, как железные или калийные квасцы, происходит сильная положительная перезарядка красителя. Железные и квасцовые лаки, имеющие сильный положительный заряд, красят прогрессивно, как основные каменноугольные крастели.

Это объяснение вполне пригодно для усвоения лаборантами со средним образованием.

Вам очень повезло, что Ваша лаборатория использовала и использует хороший рецепт и правильную процедуру.

А я хорошо помню, что когда пришел в свою лабораторию, (только что закончив медучилище как фельдшер в 1993), то мы еще почти 2 года ходили и трясли 10-литровый баллон с марлей на горле - помогали созревать раствору. И было несколько бутылок с созревшим раствором, которые время от времени доставали и пробовали, если вдруг рабочий раствор переставал красить. Такое случалось очень часто. Это позже мы добыли ртуть и сварили у себя Harris. И несколько раз попадался просто отвратительного качества порошок.
Проблемы исчезли полностью в 1995, когда научились готовить краситель. Никто особо не делился в то время информацией - и в интернете это все потом появилось. Однако, по сей день мы не испытываем никаких трудностей с приготовлением гематоксилина.

 
ЧаконаДата: Среда, 2010-06-23, 11:55 AM | Сообщение # 21
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 105
Репутация: 5
Статус: Offline
Quote (Maxim)
Поажлуйста, не путайте гематоксилин (слабо заряженный отрицательный порошкообразный краситель) и гематеин - лак (комплекс гематоксилин + протрава).

Я не путаю и понятно, что химически анион обычно трактуется как кислотный остаток (не имея ввиду теорию Льюиса и т.д.). Но по эмпирическим лабораторным классификациям гематоксилин и приготовленные из него красящие смеси все-таки всегда относили к основным красителям. Возможно, Вы неудачно выразились, но получилось противоречие, так как пример с гематеином как раз эмпирической гистологической классификации не противоречит (т.е., его относят к основным красителем. а то, что он красит - к базофильным структурам, и по теории Льюиса как раз является анионным основанием).

Добавлено (2010-06-23, 11:55 Am)
---------------------------------------------

Quote (Maxim)
Вам очень повезло, что Ваша лаборатория использовала и использует хороший рецепт и правильную процедуру.

Хм... Лаборатория до меня ничего не использовала, так как до меня ее просто не существовало. Всю микротехнику я освоил без всяких учителей. Соответственно, никаких особых рецептов я ни у кого не унаследовал - а готовил по общедоступным прописям по учебнику Меркулова.

 
MaximДата: Среда, 2010-06-23, 11:58 AM | Сообщение # 22
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Тогда не один я, и Ромес и другие большие и известные авторы...

И вообще, главное - результат. Большинство людей вообще и не подозревает обо всех этих тонкостях, и это им не мешает получать классные результаты.

 
ЧаконаДата: Среда, 2010-06-23, 12:03 PM | Сообщение # 23
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 105
Репутация: 5
Статус: Offline
Quote (Maxim)
Тогда не один я, и Ромес и другие большие и известные авторы...

Постойте, тут какое-то недоразумение.
Насколько я знаю, дело выглядит примерно так:
"Основные" краски: азур, тионин, гематоксилин, метиленовый синий и т.д.
"Кислые": эозин, кислый фуксин и т.д.
"Нейтральные" (условно): нейтральный красный, трипановый синий.

Разве не так?

 
RomanДата: Среда, 2010-06-23, 9:23 PM | Сообщение # 24
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Может у кого-то вызовет улыбку, но меня сегодня осенило. После ИГХ необходимо докрашивать прогрессивным гематоксилином, чтобы не дифференцировать в кислоте. Потому и рекомендуют Майера. Я варюсь в собственном соку и от официнального фирменного Майера отказался - меня не устраивало, что он медленно красит и перешел на другой гематоксилин довольно нестандартной рецептуры, где на 3гр гематоксилина 8 гр квасцов. Красил быстро и в общем хорошо, но в некоторых случаях было ощущение, что хромоген забивается гематоксилином. Сегодня после как ознакомился со статьями и просветления сознания рискнул и отдифференцировал после гематоксилина - и очень доволен результатом. Спасибо Maximу и всем. Вот так и развиваемся, на слово не верим тому, что нам рекомендуют, пока не поймем внутренний смысл этих рекомендаций и не научимся на своих ошибках. Теперь думаю: не размочить ли уже готовые стекла и не провести ли дифференцировку окраски.

От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
MaximДата: Суббота, 2010-06-26, 10:49 PM | Сообщение # 25
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Roman!
Комплекс антиген-ДАБ очень устойчивое соединение. Вы спокойно можете снять покровное стекло с архивного, хранящегося не один десяток лет и обесцветить гематоксилин полностью (если получится) и снова добиться желаемой интенсивности окраски. При этом никакого изменения интенсивности продуктов ИГХ-реакции произойти не должно. Сообщите, пожалуйста, нам всем, если это не так.
Я крашу свою ИГХ прогрессивным гематоксилином 4-5 секунд и потом после промывки в дист воде подсиниваю ядра в промывочном буфере. Фон может быть прокрашен гематоксилином при избыточной демаскировке и в этом случае, если срез не "облез со стекла", то получается красивая ядерная окраска. Тот же фокус (дифференцировку) можно попробовать и после прогрессивного гематоксилина.
В последее время (3-5 лет) я отказался от солянокислого спирта и использую 0.25% водную соляную кислоту для дифференцировки гематоксилина как для Г-Э, так и для ИГХ, амилоида (Highman, 1946) и других ГХ окраскок, где есть гематоксилин.
 
VladpathologДата: Воскресенье, 2010-06-27, 10:38 AM | Сообщение # 26
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Quote
Вы спокойно можете снять покровное стекло с архивного, хранящегося не один десяток лет и обесцветить гематоксилин полностью (если получится) и снова добиться желаемой интенсивности окраски.

Вполне согласен - вынужден был этим заниматься, когда писал диссертацию. Эндометрий окрашивался очень интенсивно и быстро гематоксилином, а лаборанты не особенно видно хотели подстраиваться под аспиранта. Продукт ИГХ-реакции сохранялся даже когда полностью (ну или почти поностью) смывался гематоксилин, причем некоторым стеклам было по пол года и больше.
 
RomanДата: Среда, 2010-09-01, 10:18 PM | Сообщение # 27
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Уважаемый Maxim, вам вопрос как признанному эксперту.
Гематоксилин Лилли, насколько я разобрался: гематоксилин 5 г, квасцы 50 г, глицерин 300 мл, вода 700 мл, уксусная кислота 20 мл, йодоватистый (извиняюсь, если неправильно написал) натрий 0,2-0,4 г
вопрос в следующем, можно ли за отсутствием последнего в качестве окислителя использовать перекись водорода, официнальную из аптеки. И без спирта хорошо ли растворяется гематоксилин.
Заранее благодарю.


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
MaximДата: Среда, 2010-09-01, 11:12 PM | Сообщение # 28
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Roman!
Для окисления в этом рецепте в оригинале рекомендую брать не более 0.2 г KJO3 (иодат натрия или калия = иодноватокислый) на 1 г гематоксилина. Можно и даже желательно брать меньше. Тут все зависит от качества красителя - это количество подбирается трудным опытным путем, ведь на этикетках с гематоксилином обычно не указывают % содержание красителя. (Вот, например, если % содержания 30 - это значит, что в 1 грамме этого порошка содежится всего лишь 0.3 г красителя, а все остальное - что угодно, но только не краситель и брать нужно для грамма красителя не 1 г порошка, а 3.3 г). И, почему-то об этом в книгах почти всегда умалчивают!
Если будет много окислителя, раствор не будет красить. Можно окислять и другими окислителями, лишь бы их было достаточное количество. Я сам не экспериментировал с другими веществами в этом рецепте.
Для окисления в дргуих рецептах используют и окиси ртути (Harris), и перманганат калия и периодат калия и перекись водорода (гематоксилин de Groot, но в смеси с феррицианидом калия). А еще используют и такую экзотику, как гипохлорит кальция (Anderson) и натрия (гематоксилин Debiden).
Тонкость в том, как попасть в нужное количество окислителя для имеющегося в растворе количества гематоксилина. Я уже не говорю о соотношении краситель-протрава, рН и других потребительских характеристиках.

Растворимость порошка гематоксилина в воде примерно 1%, а в спирте около 30%.
В водном растворе квасцов, особенно горячем, гематоксилин обычно растворяется за несколько секунд. Хотя у меня были партии красителя, которые даже в спирте с трудом растворялись - вот тогда мучался и я и окраска была отвратной. Поэтому лучше покупать нормальный сертифицированный порошок. А он стоит хороших денег.

А Вы еще пользуетесь услугами аптеки? Мы покупаем перекись водорода у поставщиков реактивов. Аптек, которые делают раствор перекиси, у нас уже не осталось. Все продают готовые фасованные растворы и они быстро пропадают.
Перексиь используем для приведения в порядок вырезки, замачивания инструментов и т.д. Купили канистру концентрированной перекиси и аптека не нужна. Дешево и сердито. Развести и сами в состоянии.

Добавлено (2010-09-01, 11:12 PM)
---------------------------------------------
И зачем Вам перекись? Иодат натрия копейки стоит. Купите грамм 500 - хватит Вам и правнукам.

 
RomanДата: Четверг, 2010-09-02, 9:44 PM | Сообщение # 29
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Репутация: 7
Статус: Offline
Уважаемый Maxim, спасибо за ответ. Хотел лаборантам облегчить жизнь, не ждать пока созреет Эрлих, но чувствую, что могу усложнить подбором окислителя. И еще: гематоксилин в пропись включается в перерасчете на чистый? т.е. если он 30%, а надо 5 г то надо добавлять 15 г? И можно ли узнать процентное содержание красителя, если оно не указано?
Перекись я имел в виду во флаконах.


От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
 
MaximДата: Четверг, 2010-09-02, 10:00 PM | Сообщение # 30
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемый Roman!
Если на банке с красителем не указано процентное соедржание красителя, для начала примите его за 100%. Позже выяснится, достаточно его или нет, т.е. возьмите 5г на литр.
Иодат натрия Вы сможет найти в подвалах практически любой клинической лаборатории - у каждой лаборатории есть такой загашник, если до него не добрались проверяющие и не заставили выкинуть просроченные реактивы. Как известно, сухие соли не пропадают даже за тысячи лет (это известно всем, но только не проверяющим, которые смотрят на сроки хранения на банках - почему-то от школьных знаний по химии у них ничего не осталось). Я все подобные трофеи держу очень надежно укрытми от глаз проверющих - долго объяснять, почему это вдруг я работаю красителем 1956 года выпуска, да еще и зарубежным. Лучше пусть не знают.
На худой конец, если не найдете одат натрия, попробуйте периодат калия или натрия в колчиестве не более 0.5 г на 1л раствора.
Никак не поворачивается язык поирекомендовать окись ртути (желтую или красную - все равно). Я делал несоклько лет рецепт Harris, но потом отказался из-за той же ртути. Окраска была вполне приличная.
Созревание красителя месяцами на окне - хорошоая технология, но для начала ХХ века. Нам всем сейчас некогда и Вы сразу ощутите прелесть химического способа созревания (окисления) гематоксилина.
Как сварите, поделитесь впечталениями - интересно.
Желаю удачи.
 
Форум » ОПЕРАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ » Методики » Гематоксилины (вопрос выбора гематоксилинов)
Страница 2 из 3«123»
Поиск: