Способы устранения фонового окрашивания - Страница 2 - Форум
 
Способы устранения фонового окрашивания - Страница 2 - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Понедельник, 2016-12-05, 7:28 AM

Страница 2 из 3«123»
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Способы устранения фонового окрашивания
Способы устранения фонового окрашивания
PatologoanatomДата: Суббота, 2009-10-17, 5:56 PM | Сообщение # 16
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 743
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (Roman)
Как вы помещали в нее стекла: в контейнере, на дно?

На дно наливается dH2O. Стекла помещаются back to back "спина к спине" в пластиковый сосуд Коплина (Coplin jar), который ставится на дно. Расход буфера около 50 мл.
 
lab_nskДата: Среда, 2010-12-01, 3:07 PM | Сообщение # 17
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Репутация: 2
Статус: Offline
Здравствуйте! Так рада, что нашла ваш форум.
Я уже не новичок в игх-анализе, но видимо пошла черная полоса. Искала множество способов устранения, а также причин возникновения фонового окрашивания. Получается с переменным успехом.(
Меня заинтересовали парочка советов: про молоко и ночь в холодильнике. Подскажите, молоко ведь должно быть обезжиренным? и соответственно, когда ставлю слайды в холодильник, разведение надо взять побольше?
Заранее благодарю!
 
VladpathologДата: Среда, 2010-12-01, 4:29 PM | Сообщение # 18
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Репутация: 13
Статус: Offline
Коллега, а с каким антителом и системой у вас наблюдантся фоновое окрашивание? Я это к чему - давно уже не сталкивался с проблемой фона, которая бы мешала диагностическому процессу. По поводу молока ничего не скажу. А про инкубацию в холодильнике - пожалуй. Использую этот метод не для снижения фонового окрашивания, а для усиления основной реакции. При этом не изменяю концентрации антител и обеспечиваю влажность, для исключения высыхания среза. Такую инкубацию использую для AnnexinA1, PD1, CXCL13, CD25 (вся четверка от Marque Cell). Не знаю почему, но такая суета у меня только с этим производителем. Вообще когда-то брал эти антитела, глядя на низкую стоимость, но практика показала, что указанные производителем разведения при средней концентрации не дают хорошей реакции - приходится использовать минимальные разведения и при этом еще ночь в холодильнике. С другими производителями без этой возни и без всякого фона. Хотя конечно не исключаю, что дело не в производителе. Про молоко - сам лично не решусь на такие эксперименты, хотя не думаю, что жирность как-то влияет.
 
lab_nskДата: Среда, 2010-12-01, 4:43 PM | Сообщение # 19
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Репутация: 2
Статус: Offline
Мы изучаем патологию легких, в целом, и патологические изменения альвеолярных макрофагов при инфицировании вирусом гриппа А мышей. Естественно, хочется добится исключительных результатов, а из-за обильных отеков и кровоизлияний - это иногда становится затруднительно. Ох, легкие такие капризные! Набор антител довольно широк, как моно-, так и поликлональных, несколько разных фирм.
Проблемы возникли именно c IL-6 («Novocastra»), VEGFR3 («Novocastra») и TGF-β («DBS»).
Система Spring.
Методика чуть модифицированная, но никак не могу понять, где я могу ошибиться - провожу блок эндогенной пероксидазы, использую для промывки фосфатный буфер, далее влажная камера, инкубация с первичными антителами в термостате (37С), затем промывка, потом комплимент, вторичные антитела и DAB-хромоген.
Всю голову сломала вобщем.
 
MaximДата: Среда, 2010-12-01, 7:43 PM | Сообщение # 20
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Уважаемая lab_nsk!
Начните проверку с качества 10% формалина. Правильно ли он сделан? Фиксация 24 часа при комнатной температуре (но не более 48 и в крайнем случае 72 часа), толщина блоков до 3 мм. 95% неудач в ИГХ кроются именно здесь, особенно если проблемы хронические или регулярные.
Далее - проводка, микротомия, приклеивание стекол и правильное высушивание (до утра 37оС) и перед депарафинированием 1 час в 60оС. Вся сушка вертикально.
Третья часть: процедура депарафинирования, своевременная смена реагентов и т.д.
Потом: качество буферов для промывки и демаскировки. Сама процедура демаскировки: прибор, время демаскировки, остывание.
Тут много всяких подводных камней, но микроволновка джля этих целей гораздо хуже, чем водяная баня или скороварка.
Далее первичные антитела, система, пероксидазный блок, ДАБ и все связанные ИГХ-реагенты. Первичные антитела должны соответствовать системе, правильный титр (тестируется по контрольным стеклам).
В конце - докраска (адекватная докраска ядер), обезвживание, просветление и заключение.

В отношении скорости реакций. Все химические реакции подчиняются закону Вант-Гоффа: скорость химической реакции изменяется в 2-4 раза (ускоряется или замедляется) при изменении температуры на каждые 10оС. Таким образом, от 25оС вы понижаете температуру до 4оС, значит и и обработка антителами должна увеличится в 8 раз (30 мин х 8 = 4 часа). Обычно оставляют в холодильнике до утра. Антитела первичные можно разводить до 100 раз или более от рекомендованных концентраций (нужно тщательное тестирование на контрольных стеклах). Хороший повод для экономии, если никто не требует быстрого результата.
Уже не говорим о сроках годности антител, соблюдении условий хранения, подсыхании срезв и пр.
И вообще, кроме чтения вкладышей к антителам большинство производителей в рамках технической поддержки на своих сайтах выкладывают методички по ИГХ окраске своих реагентов и по общим моментам ИГХ-методов.

Добавлено (2010-12-01, 7:43 PM)
---------------------------------------------
Я бы молока избегал. То ли оно должно быть естественным, то ли годится порошковое... И вообще, это не реагент для ИГХ.
Как тогда планировать включение в план закупки реагентов молоко? Или отливать из того, которое выедляется по вредности ежедневно?

Уважаемый Pathologoanatom! Поделитесь, пожалуйста, ссылкой про молоко. Просто интересно.

 
lab_nskДата: Среда, 2010-12-01, 9:08 PM | Сообщение # 21
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Репутация: 2
Статус: Offline
Большое спасибо за столь полный комментарий, но проблема, в том-то и дело! В отношении определенных антител (срок их годности и т.п., и т.д. - все соблюдено).
На счет приготовления блоков и препаратов, все окей, кроме "перед депарафинированием 1 час в 60оС" - завтра испробую!
Хочу попробовать добавить Tween 20, посмотрим, что выйдет.
Антител, кстати, точно работают, так как при окраске других органов (селезенка, почки, печень и т.д.) все нормально работает. Проблема в огромных зонах отека и кровоизлияний. Они всегда берут на себя "краситель". Может здесь кто поскажет.
Я уже все попробовала - и концентрация, и время меняла.
Конечно же, проверила адекватное соотношение всех компонентов системы. Большая проблема, что пришлось "чудесничать" на готовом, к сожалению, пока у меня нет диплома и я видимо не в праве вносить коррективы.(
Про методички - прочитала уйму, все идиально должно быть! Мне кажется голову сломаю скоро, к сожалению, не с кем было посоветоваться до этого момента.)
Однако, хотелось бы выразить огромную благодарность за вашу отзывчивость. Буду искать причины.)
 
MaximДата: Среда, 2010-12-01, 9:43 PM | Сообщение # 22
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Эритроциты и зоны с плазмой всегда окрашиваются ДАБом, и даже есть рекомендации подбирать для окраски препараты, в которых этих вещей нет (если такое возможно). Если иначе нельзя - не обращайте внимания на эти участки.

Что касается любых изменений в протоколе, то они должны быть одобрены патологом, оценивающим материал (он несет ответственность за любые изменения) и только после серий параллельных окрасок по старому и новому протоколу. Для контроля нужно брать по 25 пар стекол минимум для каждой переменной (время инкубации - одна переменная и т.д.). Разумеется любые изменения должны тестироваться на безупречно работающих контролях. Такая работа часто не под силу загруженным лабораториям и поэтому либо оставляют все без изменений, либо по-тихому лаборанты меняют что-то на свой страх риск, тем самым подставляя под удар и патолга и репутацию всего учреждения, не говоря о возможных рисках для здоровья пациента. Для исследовательских лабораторий такие вещи вообще недопустимы, ибо однажды испорченную репутацию ученный уже никгода не сможет восстановить.

А куда Вы хотите добавить Tween20?
С ним тоже нужно аккуратно - избыток его тоже вреден.

Нагрев 1 час в 60оС перед депарафинированием нужен для полного удаления влаги из-под среза, иначе срезы просто облезут в самый неодходящий момент.

 
lab_nskДата: Среда, 2010-12-01, 10:07 PM | Сообщение # 23
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Репутация: 2
Статус: Offline
Твин хочу добавить в промывочный фосфатный буфер, попробовать от 1 до 3 мкл.
Методики часто подбираются так сказать индивидуально для группы антител, исходя из источников литературы и собственных результатов, конечно же все под контролем, я конечно же соблюдаю все необходимые этапы.
К сожалению, зоны отека и кровоизлияний масштабны - они-то и являются "фоном".
Просто я думала, что есть возможность избавиться от фона или же сделать его минимальным, конкретно в моем случае. Но получается, что бьюсь над этим зря. Просто потрачено на это дело было столько сил, что уже и не знаешь в чем сомневаться.)
Но чем больше узнаешь, тем меньше остается вариантов где исправлять. Срезы, к слову, ни разу не облазили и не слетали, но попробовать увеличить температуру все же стоит.
 
niksavelovДата: Среда, 2010-12-01, 10:24 PM | Сообщение # 24
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Quote (Maxim)
Эритроциты ... всегда окрашиваются ДАБом

Я бы сказал по-другому: При правильной обработке эритроциты никогда не окрашиваются ДАБом.

Вообще же, что бы попытаться разобраться в проблемме необходимо знать ещё некоторые моменты.
1. Ни слова не было сказано про демаскировку антигенов - а она вообще проводится? Если да, то каким образом (раствор, режим обработки)?
2.

Quote (lab_nsk)
потом комплимент
- можно по-подробнее про этот этап.
3. Какие антитела работают на том же самом материале при том же протоколе без данного вида фона?
4. Укажите не только название антител, но и их источник (кролик, мышь). Как я понял работа проводится на мышиных тканях. Если те антитела, что не фонят кроличьи, а те что фонят мышиные - тогда всё логично. Анти-мышиная система детекции красит эндогенные мышиные иммуноглобулины, содержащиеся в плазме крови. При данном виде фона, в тех образцах где нет кровоизлияний и выраженного отёка, фоновое окрашивание должно быть видно в просветах сосудов.


Никита Савёлов
 
lab_nskДата: Четверг, 2010-12-02, 6:36 AM | Сообщение # 25
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Репутация: 2
Статус: Offline
Вы бы не могли поделиться в чем заключается правильная обработка эритроцитов?

Вначале провожу депарафинизацию, потом регидратацию и затем подвергаю слайды демаксировке антигенов в микроволновой печи мощностью 700W, в течение 20-25 минут. Использую чаще всего цитратный буфер (1:100). Насколько уже поняла - скороварка лучше, но, к сожалению, у нас ее нет. Хотя прочитав статью об ИГХ и микроволновой обработке препаратов, можно легко думать обратное.

3. Работает довольно большой спектр, например СD68, Inf A, Cath D(не трогает отек, но все же окрашивает эритроциты с плазмой) и различные апоптотические белки. Если без фактора роста сосудов я еще проживу, то IL-6 и TGF-betta мне очень нужны.

4. Ну поскольку все антитела у меня анти-маус, следовательно наработаны они были либо в кролике, либо в крысах. В каком именно животном это было осуществленно - надо уточнить, но я всегда полагала, что важно только подобрать правильно первичные и вторичные антитела ( ну и т.к. у нас все таки мыши - антимаус).

 
MaximДата: Четверг, 2010-12-02, 6:42 AM | Сообщение # 26
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Твин нужен в промывочном буфере для двух вещей.
1. Он улучшает проникновение реагентов в срезы.
2. Замедляет испарение водных растворов.
Я в любом случае пользуюсь буферами с Tween.
А при резке срезов добавляю 2-3 капли Tween 20 в ванночку для сбора срезов - уменьшается поверхностное натяжение воды и поверхность изначально немного выпуклая становится ровной. Все-таки это неионное ПАВ (поверхностно-активное вещество).
В такой воде срезы очень хорошо расправляются.

И вообще, фоном принято называть неспецифическое и равномерное окрашивание всего среза. Локальные коричневые гранулы - это осадки ДАБ. И любое локальное прокрашивание - это уже не фон. В случае у lab_nsk,как я понял, четкое прокрашивание определенных структур (эритроциты и плазма). Нет же заркаски всех других струткур, кроме искомых? Если так, то это вопросы к типу антител , истемы и тканией, как пишет niksavelov.
Я не думаю, что дело здесь в демаскировке.

 
niksavelovДата: Четверг, 2010-12-02, 12:33 PM | Сообщение # 27
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Судя по всему тут и вправду анти-грызунячья система детекции красит эндогенные иммуноглобулины мыши. Для проверки этого предположения надо сделать следующее: Посмотреть какие антитела из крысы. Затем той системой детекции, которой обычно выявляют эти крысиные антитела, просто покрасить срезы используя соответствующий протокол, но первые антитела не добавлять (этот этап лучше просто пропустить, а не заменить его инкубацией с крысиной сывороткой). Если система детекции даст характерное фоновое окрашивание, то все крысиные антитела надо просто заменить на кроличьи и выявлять реакцию антиген-антитело исключительно анти-кроличьей системой детекции, а не универсальной против кроличьих и мышиных антител.

Добавлено (2010-12-02, 12:33 PM)
---------------------------------------------

Quote (Maxim)
И вообще, фоном принято называть неспецифическое и равномерное окрашивание всего среза.

Не совсем согласен с этими утвержденьями. Под фоновой реакцией (background) принято понимать все те виды реакции, когда нарушена микроанатомическая локализация "сигнала". Этим фоновое окрашивание и отличается от перекрёстной реакции или аберрантной экспрессии. В зарубежной литературе очень часто не разделяют понятия фон (background) и ложно-положительная реакция (false-positive). Поэтому фон - это не только когда антитела неправильно оттитрованы, но так же и неспецифические гидрофобные и электростатические взаимодействия. А последние виды неспецифических реакций не дают равномерного окрашивания среза.
Quote (Maxim)
Локальные коричневые гранулы - это осадки ДАБ. И любое локальное прокрашивание - это уже не фон.

С формальной точки зрения "неспецифическое равномерное окрашивание" - это то же осадок ДАБ, а что же ещё мы видим в микроскоп?


Никита Савёлов
 
MaximДата: Четверг, 2010-12-02, 6:53 PM | Сообщение # 28
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
В микроволновках почему-то многие уверены, что это хороший инструмент для демаскировки. Да, ее можно приспособить для этой цели, но требуется очень большая работа. В каталоге файлов этого форума Вы найдете презентацию о калибровке микроволновой печи. Вам многое станет понятно.

Фоновая реакция в ИГХ вещь действительно вобщем неопределенная и есть много других трактовок. Например, в методичке по окраске Dako (с 3 по 5 издания) фоном называют любую неспецифическую окраску, которая является результатом процедуры и иногда "нежелательную" окраску, вызванную диффузией антигена. Я например очень часто вижу диффузию антигена Ki-67 в неправильно зафиксированных тканях. Причину давно установили, но бороться не под силу - бюрократические заморочки.

Следовательно, смысл один: фон, это когда красится не должное.

 
lab_nskДата: Пятница, 2010-12-03, 3:16 PM | Сообщение # 29
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Репутация: 2
Статус: Offline
Уважаемые коллеги! Всем спасибо за помощь и советы. Попробовав практически все, что вы советовали - действительно удалось (наконец-то!) победить TGF-betta и IL-6!!
Использовала твин, заменила Dako дилюент на da vinci, оставила на ночь с первичными антителами, затем промывала около часа - и все удалось!)
На следующей неделе уже буду проверять правильно ли калибрована наша микроволновка. Хотелось бы конечно попробовать скороварку, но, к сожалению, это пока невозможно.

niksavelov, подскажите, пожалуйста, как правильно обрабатывать слайды, чтобы эритроциты не окрашивались ДАБом. Буду премного благодарна!!)

 
niksavelovДата: Пятница, 2010-12-03, 4:19 PM | Сообщение # 30
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Вроде всё очень просто - 15 мин 3% водный р-р перекиси водорода при комнатной температуре и всё. В перекись лучше добавить Твин20. Эритроциты становятся абсолютно прозрачными. Бояться такой обработки совершенно не стоит. Антигены это не убьёт, если делать её после демаскировки, а не до. При демаскировке антигенов путём нагревания срезов в водном растворе хелаторов двухвалентных ионов (EDTA, цитрат) из ткани удаляются не только ионы кальция, но и железа - это уже само по-себе снижает пероксидазную активность. Поэтому выраженного образования свободных радикалов в ткани не происходит, а такую длительную обработку мы применяем что бы добить все псевдопероксидазные активности.

Никита Савёлов
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Способы устранения фонового окрашивания
Страница 2 из 3«123»
Поиск: