Способы устранения фонового окрашивания - Страница 3 - Форум
 
Способы устранения фонового окрашивания - Страница 3 - Форум
[ Новые сообщения · Участники · Правила форума · Поиск · RSS ]
Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2016-12-09, 10:45 AM

Страница 3 из 3«123
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Способы устранения фонового окрашивания
Способы устранения фонового окрашивания
lab_nskДата: Пятница, 2010-12-03, 4:30 PM | Сообщение # 31
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Репутация: 2
Статус: Offline
У меня время обработки меньше - 7 минут (также 3% раствором). Попробую увеличить.
Твина сколько добавлять? я в промывочный буфер добавляла 6 мкл твина на 600 мл буфера. А с перекисью как?
И потом, если не сложно, объясните зачем необходим ЕДТА, вроде ацетат только кальций "берет". А он, исходя из статьи, представленной на этом форуме, итак разрушается при обработке в микроволновке (срезы в цитрате)?
 
niksavelovДата: Пятница, 2010-12-03, 4:48 PM | Сообщение # 32
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
1 мл Tween 20 растворить в 400 мл 3% водного р-ра Н2О2.
До конца механизм работы EDTA не известен. Для меня очевидны две вещи: 1. EDTA более эффективный хелатор ионов кальция чем цитрат. 2. Буферы с EDTA имеют щелочной рН и в них происходит слабый щелочной гидролиз, способствующий восстановлению структуры большинства конформационных эпитопов, разрушенных при формалиной фиксации.


Никита Савёлов
 
PatologoanatomДата: Суббота, 2010-12-04, 4:54 AM | Сообщение # 33
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 743
Репутация: 11
Статус: Offline
Quote (lab_nsk)
Подскажите, молоко ведь должно быть обезжиренным? и соответственно, когда ставлю слайды в холодильник, разведение надо взять побольше?

Обезжиренное молоко (приготавливать из магазинного порошка, для экономии и для научных целей в самый раз!). IHC World - skim milk.
Первичное антитело можно сильнее развести (меньшая концентрация).
Quote (Maxim)
Уважаемый Pathologoanatom! Поделитесь, пожалуйста, ссылкой про молоко. Просто интересно.

Уважаемый Maxim. Методику опубликовали Miller RT, Kubier P, Reynolds B et al: Blocking of endogenous avidin-binding activity in immunohistochemistry: The use of skim milk as an economical and effective substitute for commercial biotin solutions. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 7(1):63-65, 1999.
Суть кратко описана на IHC World. Dabbs в поледнем издании тоже ссылается на Miller R.T. et al.
 
MaximДата: Суббота, 2010-12-04, 9:56 PM | Сообщение # 34
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 478
Репутация: 25
Статус: Offline
Спасибо за ссылки, Pathologoanatom!
Сайт знакомый, да не все прочел на нем.

lab_nsk:
ЭДТА и цитрат оба хорошо связывают кальций. Это свойство чаще используют в гистологии для удаления кальция.
Если бы вся проблема демаскировки заключалась в связывании кальция, то и проблем бы не было. А тут нужно разрушить перекрестные связи белков с формалином и для этого прибегают к нагреванию в буферах. Вот и мучаемся мы все, разрушая за 20-40 минут при нагревании в буферах с рН 7 или 9 химические связи, которые образовались в течение 24-48 часов (фиксация). Вся трудность в том, что сначала ткани должны быть тщательно зафиксированы, а потом также тщательно восстановлены. Оба процесса мучительные и неизбежные для большинства антигенов.

 
БеляшДата: Суббота, 2011-01-22, 11:21 AM | Сообщение # 35
Лейтенант
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 9
Репутация: 0
Статус: Offline
Для устранения фонового окрашивания очень помогает авидин-биотиновый блок, особенно при работе с тканями с высоким уровнем эндогенного биотина (печень, почки, селезенка). Нас он просто спас;) Подробности можно прочитать на ihcworld.
 
niksavelovДата: Понедельник, 2011-01-24, 8:49 AM | Сообщение # 36
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Для устранения фонового окрашивания при котором очень помогает авидин-биотиновый блок, так же очень помогает использование полимерных систем детекции вместо страптавидин-биотиновых!

Никита Савёлов
 
БеляшДата: Вторник, 2011-01-25, 7:31 PM | Сообщение # 37
Лейтенант
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 9
Репутация: 0
Статус: Offline
Quote (niksavelov)
Для устранения фонового окрашивания при котором очень помогает авидин-биотиновый блок, так же очень помогает использование полимерных систем детекции вместо страптавидин-биотиновых!

Никита, иногда, по ряду причин, люди вынуждены использовать именно стрептавидин-биотиновую систему детекции;)
 
niksavelovДата: Вторник, 2011-01-25, 11:35 PM | Сообщение # 38
Профессионал
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 41
Репутация: 3
Статус: Offline
Если не секрет - это причины технологического или финансового свойства?

Никита Савёлов
 
БеляшДата: Воскресенье, 2011-01-30, 8:44 AM | Сообщение # 39
Лейтенант
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 9
Репутация: 0
Статус: Offline
Quote (niksavelov)
Если не секрет - это причины технологического или финансового свойства?

Причина проста: на данный момент в лаборатории используется стрептавидин-биотиновая система детекции, поэтому пока приходится работать на том, что есть. А вот ежели мне захочется что-то изменить, то проблемы финансового свойства, думаю, выйдут на первый план;)
 
HaricДата: Воскресенье, 2011-07-10, 6:21 PM | Сообщение # 40
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Репутация: 0
Статус: Offline
Добрый день! Нуждаюсь в совете.
Мы проводим исследование кожи при различных заболеваниях. Требуется визуализировать в биоптатах кожи (фикс. формалином) субпопуляцию Т17-хелперов. Маркерами этих клеток могут служить ИЛ17 и ядерный рецептор RORC (Retinoid-related orphan receptors gamma). Мы выбрали последний, использовали антитела от Abcam - ROR gamma antibody, ab78007. Вышло неказисто - мощное окрашивание всего эпидермиса и всех клеток дермы (цитоплазма и мембрана). Идентифицировать клетки невозможно. До этого было выполнена ИГХ Foxp3 (для визуализации Т-регуляторных клеток) - получен прекрасный результат. Система визуализации одна и та же - Envision (Dako, Дания), хромоген - ДАБ. Остальное все по общепринятой методике - истощение пероксидазы, демаскировка антигенов (нагревания в соотв. растворах в течение 30 мин. при температуре 95°С в водяной бане). Инкубацию срезов с первичными антителами проводили в течение 18 ч. при температуре +4°С, инкубацию с системой визуализации - 30 мин. при комнатной температуре, для проявления результата реакции ДАБ наносили на срезы на 5 мин.

Подскажите, пожалуйста, кто-нибудь работал на коже с антителами к RORC? Может быть есть опыт исследования Т17-хелперов другими антителами.

Как можно выложить фотографии препаратов. Вот ссылка на фото: *****

Заранее спасибо. Владислав.
 
lab_nskДата: Понедельник, 2011-07-11, 11:41 AM | Сообщение # 41
Иммуногистохимик
Группа: Проверенные
Сообщений: 11
Репутация: 2
Статус: Offline
Quote (Haric)
при комнатной температуре, для проявления результата реакции ДАБ наносили на срезы на 5 мин.


Мне кажется, что это многовато. Я когда красила кожу, правда на другое Ат, под контролем микроскопа хватало около 40 секунд на ДАБ.
Попробуйте тоже поконтролировать под микроскопом и вероятно взяли бОльшую концентрацию, чем нужно.
Так же, по моему опыту, Abcam'овские Ат работают всегда безотказно.
Удачи (:
 
HaricДата: Понедельник, 2011-07-11, 11:18 PM | Сообщение # 42
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Репутация: 0
Статус: Offline
Спасибо за совет! Пробовали концентрацию уменьшать, не помогает. Это новые антитела у Abcam.
 
AnitraДата: Вторник, 2011-07-19, 11:55 PM | Сообщение # 43
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Репутация: 2
Статус: Offline
При использовании стрептавидин-биотиновых систем обычно и правда хорошо помогает биотин-блок, например http://www.springbio.com/documents/DBBXXXAvidin_Biotin_RUO_A.pdf
Это обычно 2х-компонентный реактив
Вначале инкубируем с раствором стрептавидина
Потом со свободным биотином
Получается что все лишнее связывается.

Опять же протеиновый блок

Также можно поэкспериментировать с промывками (например использовать буфер с твином)
Увеличить время промывок...

Время и температура инкубации с антителом тоже важно.
Сейчас жарко... Далеко не рум темпрече.... smile Может стоит убирать стекла в термостат с постоянными 25 градусами.
Снизить время инкубации.

Но все равно желаю вам безбиотиновой системы детекции!

ЗЫ: в последнее время слышала плохие отзывы на Абкам от сибиряков. Даже странно. Тут все так хвалят...


Червяк длинный, а жизнь короткая

Сообщение отредактировал Anitra - Вторник, 2011-07-19, 11:59 PM
 
HaricДата: Среда, 2011-07-20, 7:33 AM | Сообщение # 44
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Репутация: 0
Статус: Offline
Спасибо за совет! С твином экспериментировали, с экспозицией и температурой тоже. Нет специфичности. Эндотелиоциты красятся ярче, чем лимфоциты. Отправили рекламацию в Abcam...
 
AnitraДата: Среда, 2011-07-20, 11:36 PM | Сообщение # 45
Майор
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 31
Репутация: 2
Статус: Offline
Прямо-таки загадка... Надеюсь что когда придет ответ вы с нами поделитесь.
Любопытно чем дело кончится.


Червяк длинный, а жизнь короткая
 
Форум » ИММУНОГИСТОХИМИЯ » Технические вопросы » Способы устранения фонового окрашивания
Страница 3 из 3«123
Поиск: