Вы вошли как Гость
Текущая дата: Суббота, 2024-04-27, 7:47 AM
|
Демаскировка антигенов
|
|
| Patologoanatom | Дата: Вторник, 2006-10-03, 2:33 AM | Сообщение # 1 |
 ___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| | Quote (Vladpatholog) | | Ну вот и на моей улице праздник - бюро приобрело ретривер - Наконец-то срезы не отваливаются от стекол! видимо в микроволновке (даже как-то неудобно говорить о том, что мы ей пользовались до сих пор) не хватало давления. |
Уважаемый Vladpatholog,
Термическая обработка гистологических срезов в микроволновой печи с целью демаскировки антигена - не такая уж и плохая методика.
Иммуногистохимия, как и любая изысканная кухня требует творческого подхода. Следует учитывать тип буферного раствора, его pH, искомый антигенный эпитоп. Большинство компаний производителей антител снабжает специалистов информацией о рекомендуемом типе обработки ткани (энзиматическом, тепловом), буферном растворе с учетом типа фиксатора и тканевой обработки. В разных случаях требуются разные методы. Например для ИГХ окрашивания с одним антителом лучше использовать обработку в водяной бане, с другим микроволновка, а с другими рисоварка или пароварка. Звучит забавно, но это так. Кроме того каждый раз рекомендуется титровать антитела.
Для избежания отскакивания материала от стекол требуется применение положительно заряженых предметных стекол (с меткой x в нижних углах) или обработанных полилизином.
Лучше использовать стандартизованные протоколы, но каждая лаборатория имеет свои секретные рецепты.
Сообщение отредактировал Patologoanatom - Вторник, 2006-10-03, 2:36 AM |
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Воскресенье, 2006-10-15, 1:16 PM | Сообщение # 2 |
 Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Вот как оказывается, спасибо за информацию, но вот ведь как получается при попытках использовать полилизином покрытые стекла в условиях микроволновой печи при диагностике лимфопролиферативных заболеваний успеха не достигли, срезы и правда отскакивали от стекол, а теперь вроде ничего работает. А про рисоварку забавно - не уж то правда.
к.м.н, заместитель начальника Красноярского краевого патологоанатомического бюро.
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Понедельник, 2006-10-16, 3:35 PM | Сообщение # 3 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Просматривал материалы Dako, ссылку на которые дает patologoanatom.
посмотреть ссылку И действительно интересно - оказывается до сих пор нет однозначного ответа на механизмы демаскировки антигенов при тепловой (и не только) обработке материала.
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Четверг, 2006-10-19, 3:54 AM | Сообщение # 4 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Vladpatholog, спасибо за продолжение дискуссии. Краткая теоретическая предпосылка по поводу демаскировки или восстановления антигенной специфичности тканей, фиксированных формалином.
Считается, что при фиксации тканей в формалине, белки меняют свою структуру, образуются метиленовые мостики между белковыми молекулами. Метиленовые мостики, сшивки маскируют антигенные детерминанты. Исходя из дефиниции иммуногистохимии (ИГХ), данной Ю.А. Криволаповым (С) для иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания на гистологическом срезе необходимо осуществление реакции антиген-антитело, становится очевидным, что результаты ИГХ без предварительной обработки ткани, будут отрицательными для большинства антител.
Очень полезная публикация по теме демаскировки антигеннов теоретической предпосылкой была опубликована в Архиве Патологии в 1999 году (см. ссылку). | Quote (Vladpatholog) | | А про рисоварку забавно - не уж то правда. |
Совершеннейшая правда.  Предоставленное окрашивание антителом СD61 выполнено с использованием теплового воздействия на ткань почки в рисоварке. В качестве буферного раствора использован DAKO Target Retrieval Solution в течение 20 мин (95-98 C).
История такова: долго мучился с ИГХ окрашиванием DAKO-вским антителом к СD61, выявляющим тромбоциты. Использовал различные виды демаскировки. После консультации со специалистом с DAKO, котрый меня учил работать на аутостейнере, получил хорошее специфичное окрашивание. Консультант считает рисоварку лучшим оборудованием для демаскировки антигенов.
Сообщение отредактировал Patologoanatom - Пятница, 2006-11-10, 2:27 AM |
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Четверг, 2006-10-26, 11:02 PM | Сообщение # 5 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Уважаемый Vladpatholog,
Окрашивание почки антителом к CD61 проводилось с целью диагностики патологии из группы тромботических микроангиопатий. Для выявления тромбоцитарно-фибриновых тромбов можно, конечно было, воспользоваться окраской по Зербино, но в данном случае еще был научный интерес. Дизайн которого не имею права сообщать.
| Quote (Vladpatholog) | | А на счет ретривера угадал, вот только не пойму как. |
Элементарно, Vladpatholog!
При наборе ключевых слов по теме иммуногистохимии, демаскировки, или тканевых матриц в русскоязычных поисковых системах можно найти пока не очень большое количество информации.
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Четверг, 2006-11-16, 3:49 PM | Сообщение # 6 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Имеется проблемка - фоновое окрашивание материала, что бы предпринять. Вероятно материал староват, вероятно фиксировался не должным образом. Уж так фонит, причем далеко не в отношении всех антител, я вот и думаю - быть может попробовать увеличить разведение антител, как кто думает... 
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Четверг, 2006-11-16, 6:21 PM | Сообщение # 7 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Для устранения фонового окрашивания можно предпринять:
протитровать антитело (развести а разных соотношениях, это уже Вы предложили сами);
подержать стекла в растворе перекиси водорода 0,04% с метанолом в течение 10 мин до накладывания первичного антитела;
подержать стекла в растворе перекиси водорода 0,04% с молоком в течение 20-30 мин до накладывания первичного антитела;
использовать для разведения первичного антитела DAKO antibody diluent with reducing background component;
использовать DAKO Protein block (CodeX0909);
сменить систему детекции, вместо LSAB использовать Envision+;
в промывочном буфере использовать компонент Tween-20;
можно поиграть еще с буферными растворами для тепловой обработки Перечислил наиболее общие в практике способы без учета специфической ситуации.
Если будет время распишу рекомендации более академично.
Vladpatholog, скажите что за антитело, ткань, ситема детекции и.т.д?
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Пятница, 2006-11-17, 3:27 PM | Сообщение # 8 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
|  Попробуем, касательно более полной информации предоставлю позже, когда соберу все данные точно.
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Пятница, 2006-11-17, 6:32 PM | Сообщение # 9 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Еще один хороший способ устранения фона: overnight staining. Наложить первичное антитело в большем разведении на стекла, поместить их в инкубаторе в холодильник (+4oC) на ночь, вторичные антитела накладывать на следующий день, после промывки естественно. И рекомендую очень хорошо промывать стекла после вторичного антитела. Если промыть недостаточно можно получить грязноватый фон, распространяющийся не только на ткань, но и на окружающее стекло в виде буроватого преципитата. Маркер, спешащего гистотехнолога.
|
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Суббота, 2006-11-18, 2:08 PM | Сообщение # 10 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Вот собственно коллеги, что мне не нравится. Ткань – эндометрий как видите. (х40). ИГХ с CD34. Толстыми светлыми стрелками обозначены продукты реакции, объяснить которые не составляет труда – в первом случае эндотелий, во втором случае это возможно моноцит. А вот на счет остального, всего что обозначено узкими стрелками вопрос – вероятно плохо промыли? результат неправильной проводки?...
 На этом снимке вопросов еще больше – продукт реакции удивил – CD4 прокрасил ядра клеток стромы, апикального эпителия, и собственно цитоплазму последнего, а ведь должен окрасить цитолемму?
|
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Понедельник, 2006-11-20, 3:52 AM | Сообщение # 11 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Уважаемый Vladpatholog,
неспецифическое окрашивание есть, но не настолько страшная окраска. Окрашивание эндотелия выглядит более насыщенно, чем мембраны, цитоплазма и ядра элементов цитогенной стромы. Матрикс тоже немного фонит (на вторoм снимке).
Что можно посоветовать: сравнить препараты с контролем. В качестве контроля можно взять плаценту с сосудами и почку, окрашивание провести в идентичных условиях, сравнить с эндометрием. Еще один хороший внутренний контроль в этом же препарате (не показан на картинке)- эритроциты, если они прокрасились DAB субстратом, следует развести первичное антитело. Кстати, демаскировка с протеиназой или тепловая обработка? Если несложно сообщите компанию-производитель и клон антитела. Подумаем, что еще можно предпринять.
CD34 может экспрессироваться многими клетками, правда насчет цитогенной стромы в литературе специально не искал.
Если Вы не планируете использовать какую-нибудь софтину для подсчета плотности микрососудов по Chalkley, и анализом в ImageJ, то окраска вполне годится для обычного полуколичественного анализа, сосуд четко визуализируется.
Сообщение отредактировал Patologoanatom - Суббота, 2007-09-01, 2:28 AM |
| |
| |
| Vladpatholog | Дата: Понедельник, 2006-11-20, 2:50 PM | Сообщение # 12 |
|
Генерал-лейтенант
Группа: Администраторы
Сообщений: 638
Статус: Offline
| Да подсчет будет проводиться с использованием программки ImageTool..., может быть осилю "Видеотест" - он мне не нравится. Подробности окраски сообщу позже.
к.м.н, заместитель начальника Красноярского краевого патологоанатомического бюро.
|
| |
| |
| Roman | Дата: Вторник, 2007-01-09, 10:10 PM | Сообщение # 13 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Уважаемый Patoloqoanatom,
увидел в фотогалерее и оценил изображение ИГХ с антителами фактору VIII.
Позволил себе разместить собственные первые опыты ИГХ реакции с фактором Виллебранда с просьбой, если возможно, компентентного консультирования: что мы получили адекватную реакцию или сплошь фон и артефакт?
В нашей глуши посоветоваться не с кем. Заранее спасибо.
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
Сообщение отредактировал Patologoanatom - Вторник, 2007-01-09, 10:54 PM |
| |
| |
| Patologoanatom | Дата: Вторник, 2007-01-09, 11:07 PM | Сообщение # 14 |
|
___
Группа: Администраторы
Сообщений: 755
Статус: Offline
| Уважаемый Roman,
Окраска неплохая. У меня такие же препараты с CD34. Просто я выставил на обозрение лучшие поля зрения 
Я думаю, Вам следует немного разбавить первичное антитело (предварительно оттитровать, поиграть с серийными разведениями). Разведенное антитело даст более специфическое окрашивание. Хотя надо помнить, что лейкоциты, макрофаги, тромбоциты, даже эритроциты могут давать положительное окрашивание. Но при меньшей концентрации (большем разведении) стромальный компонент должен уйти.
Напишите какое антитело (компания, № клона), разведение, может еще что-нибудь придумаем. Демаскировка энзиматическая?
Еще может быть полезна ссылка.
|
| |
| |
| Roman | Дата: Суббота, 2007-01-20, 10:15 PM | Сообщение # 15 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Уважаемый Patoloqoanatom, спасибо за отклик и совет. Мы пользовались поликлональными кроличьими антителами к фактору Виллебранда человека фирмы Abcam. Но использовали их для выявления антигена в тканях крысы. Правда фиксировали материал в простом нейтральном формалине, незабуференном. Демаскировку проводили кипячением в микроволновке, рабочее разведение первичных антител 1:100, хотя фирма советует до 1:800. У нас разведение 1:200 не работало или делали что-то не так, малая экспозиция например (30мин). Еще один щекотливый момент: получили положительную реакцию в клетках трофобласта!? наверно артефакт.
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
|
|
