Вы вошли как Гость
Текущая дата: Суббота, 2024-04-27, 11:38 AM
|
Проводка и заливка
|
|
| Чакона | Дата: Суббота, 2010-04-17, 2:45 AM | Сообщение # 1 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| В последнее время все большую популярность приобретает техника проводки через изопропанол для заливки в парафин.
Основные особенности проводки - одна промежуточная среда, смешивающаяся как с водой, так и с парафином (напоминает старинный и жуткий диоксановый метод) и отсутствие в батарее парафиновой "каши" (впрочем, скажу я вам, и для ксилола она не нужна - я делаю без каши). Достоинства:
1). Относительно малая токсичность изопропанола по сравнению с ксилолом, толуолом, хлороформом (и, тем более, диоксаном :) )
2). Высокое качество заливки (изопропанол "не дубит" материал)
3). Быстрота (вся пропитка занимает 33,5 ч.).
4). Метод отлично подходит для ИГХ.
5). Изопропанол поставляется безводным. Недостатком является, пожалуй, только то, что изопропанол немного дороже этанола. И все. В руководстве Ю.А.Криволапова и Е.Е.Леенмана (2006) приводится следующая последовательность проводки: аИПА + ТрХ15 I смена 1 час
аИПА + ТрХ15 II смена 2 час
аИПА + ТрХ15 III смена 3 час
аИПА + ТрХ15 IV смена 4 час
аИПА + ТрХ15 V смена 5 час
аИПА + ТрХ15 VI смена 5 час
аИПА + ТрХ15 VII смена 5 час
аИПА + ТрХ15 VIII смена 5 час
Парафин I 60°С 1,5 час
Парафин II 60°С 1 час
Парафин III 60°С 1 час (аИПА - абсолютный (99,7%) изопропанол, ТрХ 15 - Тритон Х 15, добавляемый в соотношении 1 мл на 10 л. изопропанола) Вопросы для дискуссии: 1). Обязательно ли добавлять Тритон?
2). Насколько широко эта методика используется за рубежом?
3). Указанная пропись явно адаптирована под автомат (явно никто не будет круглосуточно дежурить возле банок все 33,5 ч.). Как рациональнее адаптировать эту схему под ручную обработку? С другой стороны, автоматы типа Leica, заточенные под ксилольную проводку, имеют только 2 парафиновые ванны (по 1,8 л). На всякий случай поинтересуюсь, можно ли обойтись двумя порциями парафина по 1,5 и 2 часа (интуитивно вроде ничто не мешает).
4). Каков примерный расход пропанола на 1 кусочек (как часто менять батарею)?
5). Есть ли у кого опыт проводки через изопропанол офтальмологического материала?
6). Ну, и всякие другие полезные штуки, которые кто знает. Сейчас собираемся переходить со старой спирт-ксилольной проводки на изопропанольную.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2010-04-17, 6:00 PM | Сообщение # 2 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Метод изопропанол-парафин используется очень давно. Я нашел в литературе около 10 разных модификаций этой пары реактивов. Преимущества и недостатки большинства современных методов проводки и реагентов, имеющихся на международном рынке, обсуждаются здесь:
Annals of Diagnostic Pathology 2009; Vol.13(4): 246-256.
Quote (Чакона) 1). Обязательно ли добавлять Тритон?
Добавка тритона Х100 нужна для улучшения проникновения изопропанола в ткани. Что касается рыночной стоиомсти абсолютированного изопропанола - почти 600 р/л, поэтому если делать изопропанол, как делает Ю.А. Криволпаов, то лучше самому, а не покупать готовый продукт. Рыночный абсолютированный изопропанол стоит около 600 р/л. Обычный, 99.7% стоит около 140 р/л и работает ничуть не хуже.
Основная трудность в методах изопропанол-парафин - замещение изопропанола парафином. Вот тут и начинается: пролонгированное действие парафина, нагревание его до высоких температур, спекуляция полезностью микроволн. Однако, например см.: Appl Immunohistochem Mol Morphol 2008;16:513–520. (Мы стали следовать многим из этих рекомендаций).
С физико-химической точки зрения переход между этанолом и ксилолом такой же жесткий, как и изоропанол-парафин, поэтому промежуточные этапы все же, необходимы, а дополнительный важный плюс - в безопасности для персонала и окружающей среды. Хочется, чтобы еще и результат был классный и не приходилось делить ткани на типы и тащить их по трем-четрыем разным расписаниям. Поэтому стали пользоваться изопропанолом и минеральным маслом.Добавлено (2010-04-17, 6:00 PM)
---------------------------------------------
Quote (Чакона) 2). Насколько широко эта методика используется за рубежом?
Многие лаборатории используют этот метод. Вот примеры, которые мне известны:
USA (Crawford A. Grant) (фарм. лаборатория), Prince Edward Island Pathology Lab., Canada (D.W. Brawn), Pathology Reference Lab., USA (H. Hernandez), Все лаборатории, где есть процессор Peloris™ (главным образом Австралия)., Одна лаборатория из Швеции (Falkeholm L.) Про остальных не знаю.
Но их становится все больше из-за модного следования за "зелеными".
Интересно, что большинство производителей стали разрабатывать модификации проводки без ксилола (все это те же изопропанол и парафин, однако для промывки процессора рекомендуют смеси алифатических углеводородов, которые обязательно содержат ароматические углеводороды!).Добавлено (2010-04-17, 6:00 PM)
---------------------------------------------
Quote (Чакона) 4). Каков примерный расход пропанола на 1 кусочек (как часто менять батарею)?
Эффективный расход дегидратанта 20-25 мл на кусочек (кассету). Толщина кусочка не должна превышать 2-3 мм. Последний дегидратант должен быть всегда свежим, после каждой партии. Мы вручную проводим одновременно 6 партий по 38-40 кассет в 1л банках (объем реагентов в банке 900 мл). Есть 4 смены парафина по 1 часу каждая. Парафин меняем 1 раз неделю (через 200 кассет), а промежуточные смеси (просветлители) через день, то есть после 80 кассет.
На самом деле смена реагентов - важный вопрос, и почему-то в книгах (и наших и зарубежных) он не описывается!
Quote (Чакона) 5). Есть ли у кого опыт проводки через изопропанол офтальмологического материала?
Мы проводим глазные яблоки (1-2 в месяц)через изопропанол-минеральное масло вместе со всем материалом (кости, плаценты, матки, соскобы, хирургия и аутопсия не разделяя на типы). Все получается без проблем. Ознакомиться с этим методом в общих чертах можно в Архиве патологии №3 за 2009 год с. 39. Более подробно: Annals of Diagnostic Pathology 2009; Vol.13(4): 246-256.
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Суббота, 2010-04-17, 6:43 PM | Сообщение # 3 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Большое спасибо за подробный ответ! Очень приятно обсуждать технические вопросы с глубоким профессионалом! Quote (Maxim) Annals of Diagnostic Pathology 2009; Vol.13(4): 246-256.
Quote (Maxim) Архиве патологии №3 за 2009 год с. 39.
Quote (Maxim) Appl Immunohistochem Mol Morphol 2008;16:513–520. Дело в том, что ни МГУ (где работаю я), ни мои коллеги из Гарварда (как я только что выяснил) не имеют онлайн-подписки на эти журналы. Архив патологии мне доступен с ну очень большим геморроем. Поскольку одним из авторов статьи в "Анналах" являетесь Вы, то нельзя ли приаттачить ее текст? Потому, как если уж в нашем ВУЗе она недоступна, патологам на периферии - и подавно. А дело зело нужное. Или, еще лучше - нельзя ли в телеграфном стиле привести Вашу схему, примерно так же, как тут приведена схема Криволапова?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2010-04-17, 7:29 PM | Сообщение # 4 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Проткол проводки с изопропанолом и минеральным маслом для тканей человека. Толщина образцов 2-3 мм. Фиксация в 10% нейтральном забуференном формалине не меньше 24 часов при комантной температуре или 18 часов при 40оС.
1. Изопропанол 1 час
2. Изопропанол 1 час
3. Изопропанол 1 час
4. Изопропанол 1 час
5. Изопропанол 1 час
6. Изопропанол:минеральное масло 5:1 1.5 часа при 50оС
7. Изопропанол:минеральное масло 2:1 1.5 часа при 50оС
8. Минеральное масло при 50оС от 2 часов до нескольких дней
9. Парафин 1 час при 60оС
10. Парафин 1 час при 60оС
11. Парафин 1 час при 60оС
12. Парафин 1 час при 60оС
Общее время: 14 часов (без учета перерыва на ночь или несколько дней).
Примечания:
1. Минеральное масло: вазелиновое масло, жидкий парафин. Стоимость на рынке от 85 р/л и выше. Лучше продукт для фармацевтической промышленности.
2. Задержка в минеральном масле не влияет на качество препаратов.
3. Смена реагентов: последний изопропанол новый для каждой партии, остальные передвигаются влево. Промежуточные смеси и масло после каждой второй партии, парафин последний каждую неделю (если проводка ежедневно).
4. Смеси с имзопропанолом и минеральным маслом должны быть совершенно прозрачными и не расславиваться. Это достигается после достижения указанной температуры. Поэтому сменять растворы лучше вечером, чтобы до утра они нагрелись.
5. В 1 литровой банке объем реагентов 900 мл, 35 кассет, если кусочки, 40 для соскобов, аутопсий. В нашей лаборатории есть 6 батарей, 72 банки и 3 термостата. Расход реагентов на 1 кассету: 42 мл изопропанола, 24 мл масла и 6 мл парафина.
6. Весь материал проводится без деления на типы. Эндоскопический материал проводится по другому расписанию.
Мне будет интересно знать о результатахи впечталениях.
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Суббота, 2010-04-17, 9:21 PM | Сообщение # 5 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Maxim) Мне будет интересно знать о результатахи впечталениях. Да, попробую. Возьму крысиные глаза, сердце и семенники. Правда, вазелинового масла под рукой нет, заказывать и ждать - это еще месяц (а то и больше). Начну, наверное, с Криволапова, потом попробую и Вашу пропись с маслом.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2010-04-17, 9:32 PM | Сообщение # 6 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Я начинал экспериментировать с минерального масла И-20А. На нем и всю экспериментальную часть сделал и работали на этом масле целый год, пока не нашли поставщика вазелиновго масла, почему-то японского производства.
Ну неважно, в любом автомагазине И-20А лукойловсого производства стоит не более 45 р/л. Можете спокойно пробовать.
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Суббота, 2010-04-17, 9:41 PM | Сообщение # 7 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Значит, будем пробовать. 
|
| |
| |
| Roman | Дата: Понедельник, 2010-04-19, 8:38 PM | Сообщение # 8 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Уважаемый Maxim, поясните, пожалуйста. Ваш вариант проводки, как я понял, 2-х дневный. 1-й день изопропанеол и минеральное масло на ночь. 2-й день - парафин и заливка. Но по моим подсчетам 1-й день длинный получается 8-часов или вы его разбиваете еще на два.
Заранее спасибо.
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2010-04-19, 8:58 PM | Сообщение # 9 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Roman!
В первый день мы делаем вырезку и оставляем ткани в кассетах в 10% NBF при 40оС до утра (фиксация).
Второй день: с 8:00 начинаем изопропанолы, промежуточные смеси в 13:00, 14:30 и в масло помещаем в 16:00. Уходим домой, ткани остаются в масле на ночь или несколько дней (если несколько дней, можно даже оставить при комнатной температуре).
Третий день: с 8:00 до 12:00 пропитывание парафином. Заливка в 12:00.
Режем и красим и подаем патологам на следующий день. Резать можно и в день заливки, но окрасить не все не успеем.
Итого, проводка занимает 8 часов + перерыв на ночь (16 часов) + 4 часа = 28 часов.
У нас все далается вручную. 6 параллельных батарей Х 40 кассет = 240 кассет всего. 30 банок с изопропанолом, 12 банок промежуточные, 8 масло и 24 - парафин. Перекладка занимает не более 10 минут на каждом этапе. Смена рагентов 15-20 минут.
|
| |
| |
| Roman | Дата: Вторник, 2010-04-20, 5:25 PM | Сообщение # 10 |
|
Просто профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 220
Статус: Offline
| Уважаемый Maxim, проводка ваша меня заинтересовала(мы тоже все проводим вручную, но со спиртом и хлороформом), но не устраивает 8-ми часовой цикл первого дня проводки , поскольку смена лаборанта 6 часов (вредные условия труда). А с другой стороны сломать стереотип спитово-хлороформной проводки наверно не просто.
От всего человека вам остается часть...
И. Бродский
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2010-04-20, 5:44 PM | Сообщение # 11 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Roman!
Если у Вас 6 часовой рабочий день, то перервыв в проводке можно делать практически на любом этапе: от изопропанола до масла включительно. Тогда, если кассеты ночь стоят в промежуточной жидкости 5:1, этап с 2:1 и маслом нужно делать 1.5 и 2 часа соответственно. Парафины тоже укладываются в рабочий день. А когда заливать?
Я не рекомендую оставлять в парафине кассеты до утра. Но не потому, что есть риск уплотнения кусочков (он не особенно высок), есть риск повреждения некоторых антигенов. Во всяком случае, экспертная группа по исследованию рецепторов эстрогена в молочной железе настоятельно рекомендует минимально воздействовать на ткани нагреванием и особо четко контролировать этапы парафина, чтобы не было избыточного перегрева (Appl Immunohistochem Mol Morphol 2008;16:513–520).
Если Вам нужно, пишите напрямую, перешлю свой перевод (мой оригинал к сожалению поврежден и читается не всеми ридерами). Что касается хлороформа - всемирно установленнй канцероген. Он также очень гепатотксичен и нейротоксичен.
В свое время я долго уговаривал своих избавиться от него. Решающим аргументом стало упрощение микротомии, когда мы заменили его уайт-спиритом (но и он продержался у нас всего 4 года). Зато теперь все безумно рады, что такой гаддости нет в лаборатории. Если не хотите выбрасывать его из списков веществ, за которые идет "вредность", то для комиссии утвердите внутренний протокол для окраски этиловым зеленым - пиронином, обязательной частью которого должна быть очистка порошка этилового зеленого от примесей других красителей экстракцией в хлороформе. Когда и сколько будет выполняться такая процедура комиссии все равно. Главное, чтобы был документ и где-то в дальнем углу в подвале хранился хлороформ (3-5 л). Я уверен, что когда лаборанты начнут делать эту проводку, они оценят ее перимущество. Для полной уверенности, через пару-тройку месяцев после полного перехода на изопропанол с маслом попробуйте вернуться к старому методу проводки с хлороформом на пару дней и тогда лаборанты сами ее похоронят...
|
| |
| |
| Феникс | Дата: Среда, 2010-04-21, 2:44 AM | Сообщение # 12 |
 Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 1
Статус: Offline
| Безусловно,нет предела поиску,и в том же Пирсе можно найти множество embedding-методов.В нашей лаборатории(да, думается, и во всех лабораториях страны) безотказно работает ксилольная проводка, с фиксацией в 4%формалине.С той лишь разницей, что у нас 100% этанол заменён изопропиловым спиртом - но это не отменяет наличия ксилола. Проводки ведутся в ваккуумном Tissue Processing фирмы Leica (http://www.leica-microsystems.com/products/histology-systems/tissue-processing).Качество препаратов прекрасное,диапазон приемлемости высок, и гистохимические, и иммунногистохимические окраски(я не говорю об обзорных) получаются отлично. Кстати,парафин тоже меняем раз в неделю,но это с учётом того, что у нас проходит до 300 кассет в день(на прибор,а у нас их работает 2 - один для мелкого материала, второй-для крупного и жирного).Прибор начинает свой цикл в 16:00, а к 5 утра следующего дня у нас уже готовы кассеты с материалом для парафиновых блоков.То есть,наличие прибора-автомата не привязывает лаборанта к точке старта-таймер регулирует процесс, а источник беперебойного питания страхует от форс-мажоных ситуаций.. Я, собственно, к чему?Может быть акцентировать внимание на аппаратной проводке, которая работает безотказно,зарекомендовав себя, а не изобретать велосипед?Хотя,учёные всегда будут искать,это понятно!)
Унификации хочется.Как во всём мире. Чтобы придти,встать и работать.А не вспоминать, как же это было в 50-х... Сразу хочу отметить, что отношусь ко всем собеседникам с глубоким уважением,и мотивами моего поста является желание поделиться информацией и выслушать, в свою очередь,мнение профессионалов. С уважением, Марина(Израиль)
Сообщение отредактировал Феникс - Среда, 2010-04-21, 3:08 AM |
| |
| |
| Чакона | Дата: Среда, 2010-04-21, 3:58 AM | Сообщение # 13 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Феникс) С той лишь разницей, что у нас 100% этанол заменён изопропиловым спиртом - но это не отменяет наличия ксилола.
Ээээ... Как бы, это, отменят. За простой ненадобностью. Реактив токсичный, вонючий, лаборанты его дюже не любят - и есть за что. Quote (Феникс) Проводки ведутся в ваккуумном Tissue Processing фирмы Leica Хорошая машина, годная. Quote (Феникс) Я, собственно, к чему?Может быть акцентировать внимание на аппаратной проводке, которая работает безотказно,зарекомендовав себя, а не изобретать велосипед?Хотя,учёные всегда будут искать,это понятно!)
Унификации хочется.Как во всём мире. Чтобы придти,встать и работать.А не вспоминать, как же это было в 50-х... Вы не правы абсолютно. Изопропильная проводка - по всеобщему мнению использующих ее - действительно прогресс в гистотехнике. Это как введение одноразовых микротомных бритв, кассет для проводки или заливочных станций -вроде бы ничего сверхнового, можно работать и по старинке, без них, но кто попробовал - тот вряд ли вернется к традиционной схеме. Добавлено (2010-04-21, 3:48 Am)
---------------------------------------------
Quote (Феникс) Может быть акцентировать внимание на аппаратной проводке Проблема в том, что, в отличие от Израиля, в России автоматами для проводки снабжено меньшинство патогистологических (и, тем более - гистологических) лабораторий. Если же пассаж был посвящен тому, как же это удобно - работать с автоматом! - то это, простите, банально, еще бы деньги на него кто выделял. Что же касается "акцентирования внимания", то я не понимаю, о чем речь - любая схема может быть практически без вариаций взята из ручной в аппаратную работу. Единственное - надо будет попробовать проводить в лейковском автомате, где 2 (а не 4) парафиновых ванны (удлиняя, соответственно, время пропитки). Добавлено (2010-04-21, 3:58 Am)
---------------------------------------------
Quote (Maxim) этиловым зеленым - пиронином Наверное, все-таки метиловым зеленым - пиронином 
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Среда, 2010-04-21, 5:34 PM | Сообщение # 14 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Quote (Чакона) Наверное, все-таки метиловым зеленым - пиронином
нет, все было написано верно. Я так тоже думал до июля 2007 года, пока не прочел комментарий John Kiernan (секретарь Biological Stains Comissoin) в Histonet. Вот фрагмент ответа:
Мы на самом деле не должны называть "метиловый зеленый", потому что этот краситель не производится в течение около 40 лет. Краситель, продающийся под этим именем, на самом деле называется этиловым зеленым (CI 42590) и он значительно лучше старого метилового зеленого. Смотрите Conn's Biological Stains, 9th или 10th ed, или The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators (FJ Green, 1990). Вместо ошибочно подписанных бутылей производители должны с гордостью продавать этот краситель как этиловый зеленый! John Kiernan.
Кристаллический фиолетовый (аналог генцианвиолета) является самой распространенной примесью этилового зеленого и примесь легко удаляется добавкой к 1% водному раствору обычного хлороформа. Смесь встряхивают, заливают в делительную воронку и после расслаивания смеси внизу собирается хлороформ с примесью кристаллического фиолетового (хлороформ тяжелее воды). Нижний слой с хлороформом сливают и снова добавляют чистый хлороформ в воронку и процесс повторяют до тех пор, пока хлороформ не перестанет окрашиваться.
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Среда, 2010-04-21, 6:15 PM | Сообщение # 15 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Maxim) нет, все было написано верно. Я так тоже думал до июля 2007 года, пока не прочел комментарий John Kiernan Странно. Трудно поверить, что почти полвека практически все руководства по микротехнике, а также фирмы-производители называли этот реактив ошибочно. Как бы то ни было, не думаю, что употребление правильной терминологии оправдано в данном случае - ошибочное название настолько прочно вошло в обиход, в том числе и в международные рекомендации (см., например, международные рекомендации по диагностике лимфом у мышей - BLOOD, 2002, V. 100, N 1, 246-248), что употребление термина "этиловый зеленый" приведет только к разным недоразумениям. Кстати, надеюсь, альциановый синий - это все-таки альциановый синий, а не альциановый зеленый?
|
| |
| |
|
|
