Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2024-05-03, 9:20 AM
|
Проводка и заливка
|
|
| pisikot2706 | Дата: Четверг, 2017-02-16, 11:07 PM | Сообщение # 511 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Maxim, спасибо, буду пробовать! Добавлено (2017-02-16, 11:07 PM)
---------------------------------------------
Maxim, спасибо большое! Красивые срезы. Вы писали выше, что использовали разные парафины, и что понравились только 2 фирмы. У чем разница между парафинами? Думаю и парафин поменять. Как вы советовали поступить с формалином, я сделала. Осадок растворился, сегодня положила фиксироваться материал. Надеюсь скоро придут новые и формалин, и парафин.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2017-02-17, 6:24 PM | Сообщение # 512 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Разница в парафинах обычно выражается точками плавления и составом.
Чем выше точка плавления, тем больше возможности получить большее количество тонких срезов. Ведь с каждым движением ножа о блок трение вызывает нагрев и парафина и ткани и ножа, и парафин начинает плавится. В замороженном и холодном состоянии парафин состоит из кристаллов, которые плавятся по достижении точки плавления. В этот момент даже если получалась отличная лента из тонких срезов, срезы начинают сжиматься и укорачиваться, а через 2-3 движения ножа и вовсе остаются скомканными на ноже и расправить их уже никак нельзя. Этот момент точно наступает быстрее у заливочного парафина с точкой плавления 54-56оС или ниже (да, есть и такие парафины), а у парафина с т.пл. 58-60оС это происходит гораздо позже. Кроме того, при охлаждении и замораживании твердость парафина увеличивается в разы, и относительно плотные ткани, такие как кость, мышцы, кожа, кишка и прочие проще срезаются в виде тонких срезов. При нагреве эти структуры становятся эластичными и уже не могут сопротивляться ножу в той степени, как были в замороженном состоянии и начинают немного сжиматься.
Сам парафин очень плохо срезается в виде тонких лент. Для этого в него добавляют различные натуральные и синтетические добавки, позволяющие срезам держаться друг за друга в виде лент, увеличивающие проникновение в ткани, увеличивающие точку плавления среды для заливки, а также поддерживающие форму среза и удерживающие компоненты тканей вместе. Расстраивает то, что с развитием науки и промышленности теперь имеется гораздо больше веществ, чем раньше (нам были известны пчелиный воск, стеарин, церезин, диметилсульфоксид). Новые вещества используются, без сомнения, но заливочные среды выпускаются промышленностью и детальный состав практически всегда хранится в тайне. Так как у нас нет ни знаний об этих вещества, ни возможности это попробовать на практике, ни пользоваться этим ежедневно, то остается все принимать на веру и пробовать опытным путем готовые продукты, предлагаемые промышленностью и торговлей нашему вниманию.
Вот, в результате проб разных парафинов я для себя сделал выводы: тугоплавкий парафин для заливки с добавками - это хорошо.
Проводку, конечно, правильнее делать парафином с точкой плавления ниже заливочного, потому что любые, даже самые нежные ткани, пропитанные парафином, при застывании станут тверже этой пропитывающей среды, поскольку содержат компоненты, которые изначально тверже парафина (соединительнотканные волокна, составляющие слизи, мембраны клеток и т.п.).
Тем не менее, не всегда у нас есть возможность "ковырять носом" - правила и возможности для закупки, особенно больших количеств реагентов (особенно для больших лабораторий) вносят свои коррективы. И мы должны платить деньги за готовый продукт, потому что сами не можем его сделать, как нам хочется, по самым разным причинам.
|
| |
| |
| pisikot2706 | Дата: Суббота, 2017-02-18, 9:10 PM | Сообщение # 513 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Maxim, спасибо большое за ответ!
|
| |
| |
| первопроходец | Дата: Четверг, 2017-02-23, 7:44 PM | Сообщение # 514 |
 Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 51
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги, в нашем распоряжении оказались гистопроцессоры Histo Line . Минимальная температура в реторте всех реактивов 30 градусов.
Батарея у нас такая:
формалин сколько придется, т. к. отложенный старт ко времени выхода
вода 30 мин
спирт 1 час
спирт 1 час
спирт 1 час
спирт 1 час
спирт 1 час 30 мин
спирт 1 час 30 мин
ксилол 30 мин
ксилол 1 час
парафин 1 час
парафин 1 час
парафин 1 час
Проводим операционный крупный материал и секции. На выходе имеем оооочень твердые кусочки (как кости, даже портят нож), но белесоватые (как недообезвоженные).
Мне кажется, что материал высыхает не в спирте, а недообезвоженный высыхает в теплом ксилоле. Хочу узнать ваше мнение 
Сообщение отредактировал первопроходец - Четверг, 2017-02-23, 7:45 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2017-02-23, 8:59 PM | Сообщение # 515 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Здравствуйте, Первопроходец!
Что касается обоих процессоров Histo Line (200 и 300), то у каждого есть два варианта температуры на каждой станции (кроме парафина) 35oС и ambient (окружающая среда). Просто измените настройки на ambient.
Ведь, при подъеме/снижении температруы реагентов для проводки на каждые 10оС их эффективное действие ускоряется/замедляется в 2-4 раза. То есть, при настройке в 35оС спирты должны быть не 1 час, а 30 минут, и т.д. Но основная проблема зарыта глубже. Лучше не поднимать температуру.
Проверьте, выполняются ли 4 правила фиксации (называйте их как хотите: мантры, аксиомы и т.д.):
1. 10% нейтральный забуференный формалин, каждый раз свежий (никогда повторно!)
2. Толщина проводимых объектов не более 3 мм (жира не более 2)
3. Время фиксации - не меньше 24 часов (считается с момента вырезки, не раньше!)
4. Соотношение объемов фиксатор/ткань не меньше 20/1.
Если все ок, то лучше промывку вынести за пределы процессора и делать до помещения кассет в процессор - это освободит вам еще 2 емкости и у вас будет их 10.
Delay (задержку или отсроченный старт) правильно будет сделать в первом спирте. Его концентрация будет примерно 70% (если при смене первый выливать, остальные влево на одну позицию и последний свежий после каждой партии).
Время в спиртах (я так понимаю, что это этанол 95?) при ambient установить на 1 час. Всего спиртов 5. Смена как выше написал.
Ксилолов 3 по 1 часу. Менять раз в неделю. Первый вылить, остальные влево, последний свежий.
Парафинов 3 по 1.5 часа каждый. Температура 60-64оС, в зависимости от т.пл. используемого парафина (настройка в процессоре должна быть выше на 4-5оС).
Все эти меры позволят вам иметь относительно сбалансированное расписание проводки, при котором ничего не должно пережигаться и слишком затвердевать. Условие одно: ВСЕ, ОПИСАННОЕ ВЫШЕ, ДОЛЖНО СОБЛЮДАТЬСЯ.
Есть еще несколько моментов.
- Этанол 95% обладает дубящим действием и при недостаточном времени фиксации оно усиливается.
- Слабая отмывка фосфатного буфера из фиксатора (на мой взгляд очень мало емкости реторты для этой цели!) дает возможность образования нерастворимых солей из фосфатов при действии на них спирта.
- Подъем температуры на 10оС и удлинение времени усиливали эффект обезвоживания и после удаления несвязанной воды из тканей удалялась связанная вода.
- Недостаточное время и количество станций с ксилолом не обеспечивали полное удаление спирта из объектов
- Недостаточное время для пропитывания парафином; объекты были плохо подготовлены для пропитывания парафином.
В вашем расписании период обезвоживания был примерно в 2 раза дольше просветления и пропитывания. Поэтому на выходе было то, что получалось.
Несмотря на все исправления, которые могут быть (и очень надеюсь, что будут) предприняты, этанол для костей является все-таки слишком жестким дегидратантом, а ксилол жестким просветлителем, поэтому кости нужно проводить как минимум в изопропаноле и просветлять в чем-то мягком (но не ксилоле, толуоле или хлороформе). Для костей нужно учесть еще целый ряд моментов по декальцинации.
Уверен, что у вас все наладится.
Дайте здесь знать о результате. Всегда интересено знать, что же было дальше.
|
| |
| |
| первопроходец | Дата: Четверг, 2017-02-23, 10:44 PM | Сообщение # 516 |
|
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 51
Статус: Offline
| Ох, эти мантры, которыя я прекрасно знаю, да начальству бы в уши  1. Формалин у нас не буферят 2. Толщина почти всегда в норме ( врачей около 30,попробуй достучись  ) 3. Время фиксации 18 часов 4. Соотношение с фиксатором хорошо если 1:7 . 5. Спирты и ксилолы меняем со сдвигом, это да  6. Правило Вант-Гоффа никто не знает!!! 7. Завтра выйдет материал, порежу, проанализирую, на субботу внесу изменения и отпишусь. Сфоткаю макро блоки.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2017-02-24, 12:45 PM | Сообщение # 517 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Что ж, многое у вас в лаборатории сделано верно. Остальось сделать меньше.
В своей лаборатории слайд с "мантрами" я повесил над столом вырезки. Сначала показывали патологам пальцем на этот слайд, если причина была в чем-то из перечисленного. Потом они привыкли и выполняли от них зависящее.
Фиксацию можно оставить по времени и 18 часов, но банки с кассетами ставить в термостат 40оС. Так можно достичь оптимального завершения перекрестного связывания белков формалином за тоже время. Выше поднимать темпеартуру бессмыслено - реакция быстрее не пойдет, 40оС - это предел возможного ускорения. Микроволны, ультразвук, давление и вакуум также не помощники. Это все, что еще можно сделать в ваших условиях. И это заметно улучшит результат.
Остальное, как я понял, невыполнимо. Ну, что ж, патологам тогда нужно будет сообщить, что вы предприняли все, что было в ваших силах и компетенции, и дальше все останется как есть. Теперь слово и дело будет только за ними.
А вам - терпения.
|
| |
| |
| первопроходец | Дата: Пятница, 2017-02-24, 8:49 PM | Сообщение # 518 |
|
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 51
Статус: Offline
| Это блоки после нашей проводки, первый ряд- желчные пузыри, второй ряд-л/у, опухоль, кератома. Ой, не могу прикрепить фото, выбрала файл, нажала сохранить - и ничего:((
Добавлено (2017-02-24, 8:49 PM)
---------------------------------------------
Вот с фиксацией сейчас подсчитала, выходит не плохо: 18 часов после вырезки при комнатной температуре, и около 4часов в процессоре при 30 градусах. Перерыла все меню в процессоре, не нашла варианта без подогрева реторты, парафин у нас легкоплавкий, 54 градуса, мы его разогреваем до 58. Спирт и ксилол меняем 1раз в неделю со сдвигом. Воду каждый день, первый и второй парафин раз в неделю, третий -2 раза (нет возможности менять со сдвигом, такая конструкция). Промывочные ксилол и спирт тоже раз в неделю, формалин 1 раз в неделю. Ну вот такое расписание .
Сообщение отредактировал первопроходец - Пятница, 2017-02-24, 10:03 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2017-02-24, 10:38 PM | Сообщение # 519 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Корректировку будет правильно сделать так (обязательно):
1. Формалин свежий для каждой партии. Незабуференный формалин стоит копейки - тут экономия не уместна вообще.
2. Первый спирт выливать после каждой партии, а последний свежий.
3. Ксилол и парафин менять раз в неделю со сдвигом влево.
4. С парафином что-то нужно думать - спросите технарей, как это делается. Не вычерпывать же его половником? Там должна быть какая-то система перекачки.
Это все оптимально будет в том случае, если ежедневно идет полная загрузка. При половинной загрузке, спирты можно менять через день, ксилол и парафин раз в 2 недели.
Подогрев реторты можно просто отключить: OFF или NO (в разных процессорах по-разному).
Но тепло от емкостей с парафином все рано будет подогревать реторту, хоть и не до 35оС.
|
| |
| |
| alexanderpapuga | Дата: Вторник, 2017-02-28, 5:41 PM | Сообщение # 520 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 1
Статус: Offline
| Добрый день, господа!
У меня, начинающего гистолога, есть два вопроса. Ответьте, пожалуйста.
А) Какой должна быть минимальная степень чистоты ксилола для проводки? Будет ли мимимумом "х.ч.", или можно использовать более низкую степень, а именно "ч.д.а."? (Подразумевается, что я хочу сделать хорошие препараты)
Б) Допустим, в каталоге есть два вида гистологического парафина, которые имеют характеристики "1 микрон" и "2 микрона", а я точно знаю, что мои срезы будут иметь толщину 10 микрон (точнее, я ещё этого точно не знаю, но более опытные товарищи говорят мне, что именно для моей работы не будет надобности в том, чтобы резать тоньше). Значит ли это, что я могу выбрать любой из двух предоставленных вариантов?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2017-02-28, 6:00 PM | Сообщение # 521 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Александр,
что касается степени чистоты ксилола, тут не принципиальна градация хч, чда или т - люди могут получать отличные результаты с каждым ксилолом (зависит от умения и понимания работы). Важно, чтобы реагент не был загрязнен примесями из предыдущих реагентов (если смена ксилола одна). Для проводки это не особо принципиально, и даже желательно, чтобы примеси предыдущего реагента присутствовали в первой смене ксилола. Многие ставят смеси со спиртами перед ксилолами и это действительно облегчает переход от спиртов к ксилолам.
В окраске при депарафинировании наличие примерно 5-10% парафина (из срезов) уже ухудшает процесс извлечения парафина. А при окончательном просветлении окрашенных срезов наличие даже 1% спирта в ксилоле может дать мутный препарат.
Одна из мер защиты - несколько порций ксилола на каждом этапе и своевременная замена свежими реагентами.
По сути, качество препаратов зависит не от одного только ксилола.
В отношении парафина - ни один парафин не имеет такой характеристики как "количество микрон". Это скорее относится к толщине среза. Тут тоже много составляющих влияют на количество микрон. Просто возьмите и попробуйте все виды парафина, какой лучше подойдет для ваших целей. 10-микроннный срез хорошего качества также зависит не только от парафина, составляющих очень много.
|
| |
| |
| первопроходец | Дата: Четверг, 2017-03-09, 6:25 PM | Сообщение # 522 |
|
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 51
Статус: Offline
| Добрый день! Через многочисленные варианты пришли к такому протоколу:
3 спирта по 30 мин
3 спирта по 1 часу
2 ксилола по 1 час 30 мин
3 парафина: 1 час, 1,5 часа и 1,5 часа
Воду меняем каждый день, а вот спирт и ксилол 2 раза в неделю со сдвигом. У нас 4 процессора, работают сейчас 2. Емкости по 5 литров. В каждый ежедневно загружаем 400-450 номеров крупного операционного материала, а в 4 карусельках проводится еще около 2000 номеров гастро+соскобы. Если менять все каждый день, вылетим в трубу:))). Качество операционного почти пришло в норму, только липомы сыроватые, а фиброматозные узлы и шейки - суховатые, а остальное - жить можно:))) Спасибо огромное за консультации, очень всегда помогает Ваш профессиональный взгляд!!!
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2017-03-09, 8:39 PM | Сообщение # 523 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Да, теперь Вы и сами видите, что все не так уж и сложно исправить.
Но я бы все равно сделал 3 ксилола по 1 часу для гарантии полного просветления.
С жиром существует только один способ борьбы - тонкая вырезка (не более 2 мм). Иначе никак.
Смену реагентов есть смысл делать перед прогоном эндоскопий, после них можно условно считать реактивы чистыми и не менять.
Любые другие значительные улучшения со спиртом-ксилолом уже вряд ли достижимы, ведь это все-таки грубые и жесткие реагенты.
На сухие кусочки придется "поплевать" - намочить теплой водой на 30-40 сек перед получением тонких срезов и делать срезы медленно, отличным ножом, тогда все получится вполне прилично.
Как видите, Ваши усилия увенчались существенным успехом и был не напрасны.
|
| |
| |
| первопроходец | Дата: Пятница, 2017-03-24, 2:00 PM | Сообщение # 524 |
|
Лейтенант
Группа: Проверенные
Сообщений: 51
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги, у нас беда с проводкой гастробиоптатов. Раньше они шли вместе с операционным материалом, а сейчас им выделили свою лейковскую карусель. Уже 2недели бьёмся над проводкой. Протокол такой:
Спирт 2 часа
Спирт 1 час
Спирт 40 минут
Спирт 15 минут
Спирт 15 минут
Спирт 15 минут
Спирт-ксилол 1 час
Ксилол 1 час
Парафин 1 час
Парафин 1 час
2 дня шли гастробиоптаты терпимые, с склонностью к сухости, но когда поменяли спирт, пошли просто сухари, сжавшиеся в размере и аж скрипят при резке. Режем только на 0,5 микрона, иначе крошатся. Проводим в марлевых мешочках, загрузка кассеты почти полная, сверху место только на бирочки и крышечку. Пробовали короткую проводку на 4 часа -сырые, разные другие -сухие. Может подскажете в каком направлении двигаться?
Ну ещё добавлю, что в начале у нас стоят формалин и вода, т.к. запускаем с субботы на понедельник.
Сообщение отредактировал первопроходец - Пятница, 2017-03-24, 3:13 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2017-03-24, 8:11 PM | Сообщение # 525 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| С эндоскопическим материалом обязательно нужно выполнить все правила фиксации, которые последний раз упоминались в сообщении № 515 (выше) лишь с одной оговоркой: кассетам достаточно быть покрытыми формалином.
Промывка водой также должна выполняться. Здесь достаточно 15 минут. Формалин лучше подкрашивать чем-то красным, а не гематоксилином. Красное потом отмоется в спиртах при окраске и можно будет делать любую окраску. При заливке будет хорошо отличаться место отщипывания (темное) и светлая слизистая - легко ориентировать при заливке в блоке. Гематоксилин отмыть сложнее и такого разделения не видно.
В проводке достаточно:
1. Этанол 70 (если первый прогон, потом только передвижки, а концентрация будет оставаться на уровне 75-80 примерно) 15 минут. При полных емкостях вылить после одного прогона.
2. Этанол 95 15 минут. Перелить в 1.
3. Этанол 95 15 минут. Перелить в 2. Залить свежим.
4. Этанол-ксилол 1:1 15 минут. Заменить 1 раз в 4-5 дней.
5. Ксилол 15 минут. Вылить через 8-10 дней.
6. Ксилол 15 минут. Перелить в 5. Залить свежим.
7. Парафин 20 минут. Вылить через 8-10 дней.
8. Парафин 20 минут. Перелить в 6.
9. Парафин 20 минут. Перелить в 5. Залить свежим.
Общее время: 2:30.
Этанол и ксилол - слишком жесткие реагенты для эндоскопий. Этанол дубит ткани. Ксилол пересушивает. В парафине происходит окончательное уплотнение. Поэтому частичное спасение - фиксация. При верной фиксации можно получить более-менее сносный результат. В остальных случаях - нет.
Даже, может быть в позициях 1-6 будет достаточно и по 10 минут, а в 7-9 по 15 минут. Нужно проверить.
По времени смены реагентов тоже нужно проверить. Я давно пользовался этим методом, до 2004 года. Заменил, как только представилась возможность.Добавлено (2017-03-24, 8:11 PM)
---------------------------------------------
Я бы в ночь не пускал. Утром за 3 часа все будет готов к заливке - практически ничего не потеряете. Если люди ждали 2 дня, то полдня ничего не решат.
|
| |
| |
|
|
