Вы вошли как Гость
Текущая дата: Понедельник, 2024-04-29, 1:33 PM
|
Проводка и заливка
|
|
| baigildinsamat | Дата: Среда, 2017-04-05, 9:14 PM | Сообщение # 526 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 8
Статус: Offline
| Всем добра! Помогите пожалуйста с советом. Пробовал провести на старом материале окраску с фейри. Из 6 стекол два остались приклеенными, остальные слетели. Возможные причины: фиксация больше года(примерно 1:1-5), не смешивающийся ИПС:ММ 2:1 и 5:1, 2 порции парафина, толщина среза 6 мкм(мс-2), долгое плавание среза в воде(регулирвание температуры=дист.вод+кипяток(постоянно меняющиеся)), яич. белок, сушка почти час при 60оС, потряс в фейри. Слетали и в фейри, и в воде. Мне интересны разрывы, они же не связаны с методикой Фейри? Всё до предела у нас кустарно конечно. Попробую фото разместить. Спасибо за ответ!
http://s1.radikale.ru/uploads/2017/4/5/8014bc97c62b870b87c35af44ac17d8c-full.jpg
http://s1.radikale.ru/uploads/2017/4/5/f3f51a1b2af708387842ad2f775f3d00-full.jpg
Сообщение отредактировал baigildinsamat - Среда, 2017-04-05, 9:42 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Среда, 2017-04-05, 9:56 PM | Сообщение # 527 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Депарафинирование с фейри имеет некоторые ограничения:
1. С готовностью облазят толстые срезы и плохо фиксированные ткани.
2. Не удерживаются срезы со складками, пузырями и плохо высушенные.
3. Адгезивные покрытия: полилизин, суперфрост, голд +, +, хромовоквасцовый клей. Альбумин куриный - хуже, но держится.
4. Тушь со стекол, даже с матовых поверхностей отмывается сказочно легко. Поэтому только карандаш и только на матовой полосе.
Срезы тканей правильно фиксировать (в этой ветке правила прописаны не один десяток раз). Толщина 3 мкм (лучше). Сушить 60оС термостат не менее 40 минут вертикально. Срезы можно не придавливать к стеклу, просто дать стечь воде.
В процессе депарафинирования аккуратно обращаться, не трясти, активно не макать.
Обязательно последовательная промывка в горячей дист воде и затем в теплой.
Метод дешевле депарафинирования с ксилолом примерно в 850 раз.
Работает на любых тканях. Получается ИГХ с очень красивыми и четкими картинками.Добавлено (2017-04-05, 9:56 PM)
---------------------------------------------
Да, с фиксацией проблема. Срезы толстоватые. Разрывы не связаны с методом депарафинирования.
Последовательность после 5 смен изопропанола: сначала ИПС/ММ 5/1, затем 2/1. Если используете масло И20А - обязательно нужно использовать термостат 50оС. Лучше сделать смеси вечером, чтобы они за ночь прогрелись. Прогретые смеси прозрачные, без расслойки на масло и спирт. Обязательно потом 4 парафина по 1 часу в 60оС.
Все остальные вещи изложил в предыдущем сообщении.
Фотки подтверждают сказанное здесь и в предыдущем ответе.
Я уверен, что все можно испправить и получить отличные результаты.
Успехов.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Среда, 2017-04-05, 10:03 PM | Сообщение # 528 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| С настройками микроскопа или ПО камеры также нужно повозиться.
Вот что получается после некоторого "приведения в чувство" фотографий.
|
| |
| |
| baigildinsamat | Дата: Среда, 2017-04-05, 10:16 PM | Сообщение # 529 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 8
Статус: Offline
| Хорошо, Спасибо! ММ - у меня вазелиновое масло, но куплю веретенное масло. Попробую уменьшить толщину срезов. И если что закажу клей. Просто понравился метод, другой так же проведенный срез насыщенно прокрасился, по сравнению с традиционной окраской. Если никак не получится, можно ведь сделать такую последовательность(принцип): ксилол,спирт, окраска, дист.вода, термостат, полистирол(т.е. хоть как то убирается ксилол)?прикрепляю ответ:Авто баланс белого нажимаю, из-за этого наверное. leica и zen pro вроде(2012). Разобраться надо мне со стандартами фото.
10.04.2017 похоже я ошибся, микроскоп - axio imager d2, фото - axio cam mrc5, объектив zeiss. Вроде хорошая аппаратура. Препарат - печень крысы, токс.гепатит 10х и 40х. Получил кассеты китайские, с ними попробую.
Сообщение отредактировал baigildinsamat - Понедельник, 2017-04-10, 3:46 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2017-04-06, 5:42 AM | Сообщение # 530 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Вазелиновое масло практически не смешивается с изопропанолом, даже при нагреве.
Картинки в масле получаются гораздо ярче, четче и насыщеннее, это действительно так.
Перед заключением после эозина срез можно прополоскать в воде и хорошо высушить. Можно сушить спиртами, а потом на воздухе, а можно и сразу на воздухе или в термостате. Потом заключить в полистирол. Но срез должен быть совершенно сухой, ведь если останется вода, он будет серым, мутным и с черными точками.
Баланс белого в камере - это еще не все. Сначала микроскоп по Келлеру настроить нужно. А после есть редактирование. Не вся оптика позволяет получить хорошую картинку без редактирования. Оно спасает положение и выфравнивает огрехи оптики и освещения.
А какой микроскоп, камера и объективы? (я понял, что Leica - цифры?).
|
| |
| |
| pisikot2706 | Дата: Вторник, 2017-05-16, 11:59 AM | Сообщение # 531 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Добрый день, уважаемые Maxim и форумчане. Я опять за помощью в проводке с изопропиловым спиртом и маслом. Поменяли формалин и парафин, варьировала со временем нахождения в спиртах, смесях. После вырезки фиксация 3-4 дня. Лучше получается, но что то не так. Причём режется замечательно, срезы на стекле красивые, пока не покрасишь. Куски в блоках не проваливаются. Стекла пробовала разные. Толщина кусочков 2 мм. Последний протокол такой:
1. Проточная вода 1 ч
2. 70% изопреп на ночь
3. ИПА I (изопреп из биовитрума) 1 ч
4. ИПА II 1 ч
5. ИПА III 1 ч
6. ИПА IV 1 ч
7. ИПА V 1 ч
8. ИПА + масло 5:1 1,5 ч 50 С
9. ИПА + масло 2:1 1,5 ч 50 С
10. Масло ночь 50 С
11. Парафин I 1 ч
12. Парафин II 1 ч
13. Парафин III 1 ч
14. Парафин IV 1 ч
Что делаю не так? Объект крыса. Депарафинировала в ксилоле. Ссылки на фото надеюсь получится вставить
http://ihc.ucoz.ru/photo/6/23-0-741
http://ihc.ucoz.ru/photo/fotografija_1/23-0-737
http://ihc.ucoz.ru/photo/fotografija_4/23-0-740
http://ihc.ucoz.ru/photo/fotografija_3/23-0-739
http://ihc.ucoz.ru/photo/fotografija_2/23-0-738
Сообщение отредактировал pisikot2706 - Вторник, 2017-05-16, 7:34 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2017-05-16, 8:47 PM | Сообщение # 532 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Здравствуйте, pisikot2706!
У Вас все хорошо отработано с расписанием и фиксацией. Правильно проведено депарафинирование. Ссылки работают.
Но, уверен, что в микроскопе Вы наблюдали несколько иную картинку, чем на выложенных фото. Это дефект настройки микроскопа и пользования программным обеспечением. Дело в том, что наш глаз отображает в мозг одну картинку, умея "достраивать и подгонять" нужные моменты, а матрица в камере все отображает иначе. Ей нужен другой свет, настройки, подстройки. Фото необходимо редактировать.
Я попробовал сделать небольшие коррекции. Думаю, это больше похоже на картинку в микроскопе.
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/125206601.jpg
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/618940762.jpg
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/151953146.jpg
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/405491561.jpg
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/549239107.jpg
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/551716648.jpg
Какое масло Вы стали использовать? Какая точка плавления парафина?
С моей точки зрения осбоых проблем нет ни в проводке, ни в окраске. Единственное, что мне кажется, это возможно неполное удаление парафина при депарафинировании. Может, в лаборатории холодно?
Максим.Добавлено (2017-05-16, 8:44 PM)
---------------------------------------------
Или вот ссылка на фото в галрее. Там больше изображение.
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/151953146.jpg?1494956648 Добавлено (2017-05-16, 8:47 PM)
---------------------------------------------
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/549239107.jpg?1494956718
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/405491561.jpg?1494956733
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/151953146.jpg?1494956746
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/618940762.jpg?1494956760
http://ihc.ucoz.ru/_ph/87/2/551716648.jpg?1494956801
|
| |
| |
| pisikot2706 | Дата: Вторник, 2017-05-16, 9:05 PM | Сообщение # 533 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Maxim, спасибо за ответ! Масло из автозапчастей, парафин 52-54 для пропитывания, для заливки 56-58. Камера на микроскопе у меня не очень хорошая, фото нуждаются в редактировании. Я сравниванию свои препараты с препаратами своей коллеги, она много лет делает гистологию, с этиловым спиртом, и у неё после смены формалина (сама его развожу и забуфериваю) и более легкоплавкого парафина для пропитывания стали лучше препараты получаться. А насчёт температуры в лаборатории это боль, в течение суток может меняться значительно, после праздников пришла и было вообще 9 градусов. Может лучше в термостат ставить на 37 градусов банки со спиртом?
Причём препараты кролика лучше получаются, чем крысы. Ксилолом депарафинировала, потому что много стёкол с полилизином испортила, и теперь их мою и повторно их использую. Вопрос про фейри. Остаются капельки парафина, хотя их действительно не заметно после покрытия покровным стеклом. Как технически это осуществлять? Я беру стаканы на 200 мл и нагреваю их на плитке, измеряя температуру растворов. Может это малый для 12 стёкол?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2017-05-16, 9:44 PM | Сообщение # 534 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Вообще же, это логично - использовать для проводки легкоплавкий парафин, а для заливки тугоплавкий. Просто не у всех есть такая возможность.
Любые манипуляции с подогреваом можно и нужно делать в термостате, если нет другой возможности. Даже я бы ставил ксилол в термостат с маслом, где 50оС. Примерно за час до депарафинирования, а после просто выставлял на обычное место. Также можно и нужно поступить со спиртом из батареи для депарафинирования. Я бы там использовал изопреп вместо этанола. Гематоксилин обязательно есть смысл поставить в термостат 37оС. Эозин можно просто держать на столе - с его окраской проблем минимум. Для окончательного обезвоживания термостат не нужен.
ТКани кролика легче проводить, потому что в них совсем другой хим состав белков и воды, чем в крысах и мышах. Но, вообще же при работе с большим количеством материала эти различиястановятся незаметными.
Что касается депарафинированя с фэйри, то я с трудом представляю себе поточную работу таким методом, например окраску 20-30 стоек со стеклами по 25 штук. А то бы уже многие лаборатории сократили свои расходы на окраску примерно в 850 раз. Для такого количества стекол, как у Вас хорошо может подойти пароварка, микроволновка (только нагревайте в ней сами растворы, а не стойки со стеклами), водяная баня. Люди использовали термопот, но мне кажется там температура низковатая.
|
| |
| |
| pisikot2706 | Дата: Вторник, 2017-05-16, 9:59 PM | Сообщение # 535 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Maxim, спасибо большое за помощь! Как много нового!
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2017-05-16, 10:14 PM | Сообщение # 536 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Если задумаетесь о работе с микроволновокой - пришлю еще много очень важных и полезных файлов, без которых освоить микроволновку самостоятельно практически невозможно. Е е нужно правильно использовать. И тогда она будет делать удивительные вещи.
|
| |
| |
| pisikot2706 | Дата: Вторник, 2017-05-16, 10:34 PM | Сообщение # 537 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Maxim, ого! Хорошо
|
| |
| |
| baigildinsamat | Дата: Понедельник, 2017-05-22, 2:54 PM | Сообщение # 538 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 8
Статус: Offline
| Доброго всем дня! У кого нибудь есть фото правильно заполненной банки, где соблюдено соотношение 1:20=кусок:фиксатор(10% pbs)?Просто появились сомнения, что правильно ли делаем? только что посчитали - неправильно, но все равно буду благодарен за помощь.
Сообщение отредактировал baigildinsamat - Понедельник, 2017-05-22, 3:03 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2017-05-22, 3:24 PM | Сообщение # 539 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Математика и физика в помощь.
Плотность забуференного формалина можно принять за 1: 1 г = 1 мл или 10г = 10 мл, а 20 г = 20 мл. Просто возьмите любую емкость, поставьте на весы, обнулите тару и отвесьте 20 г. Это и будет 20мл в требуемом объеме. Другими словами, кассета должна быть покрыта фиксатором.
Другой вопрос, что кассет может быть несколько и они не ровно лежат друг возле друга.
Для себя я пользуюсь такими границами:
0.5л емкость - до 25 кассет
0.75 л емкость – до 38 кассет
1 л емкость – до 45 кассет
3л емкость – до 135 кассет.
Чтобы узнать, сколько мл приходится на кассету, достаточно разделить объем на кол-во кассет.
Лучше не превышать указанные пределы.
Правильно заполненная банка: обязательно кусочки в кассетах, тогда они не слипаются друг с другом.
Насыпьте кассеты в банку и увидите сами.
Максим.
|
| |
| |
| baigildinsamat | Дата: Вторник, 2017-05-23, 7:34 AM | Сообщение # 540 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 8
Статус: Offline
| Благодарю за предоставленную информацию! Просто и в русско- и англоязычном интернете есть фотки как не надо, но нет - как надо.
|
| |
| |
|
|
