Проводка и заливка

Дата: Среда, 2010-04-28, 9:31 PM | Сообщение # 46

Профессионал

Группа: Модераторы

Сообщений: 555

Репутация: 25

Статус: Offline

Уважаемый Roman! (Прошу извинить за длину ответа)
1. По обычному "длинному протколу" у нас проводится весь материал, кроме эндоскопий. Объем соскоба ограничивается кассетой. Кассеты всегда не полные, поскольку забивание соскоба в кассеты - плохая практика. Марлю мы оставили почти 6 лет назад без малейшего сожаления.
2. "Длинный" протокол укорачивается следующими способами:
Способ 1: Изопропанолы (ИПА) по часу, промежуточные смеси по 1.5 часа, масло 1.5 для соскобов и 2 для всех других кусочков, парафин всегда 4 Х 1 часу. Всего 13.5 - 14 часов. Для соскобов можно было бы сократить каждый ИПА до 30 минут (но мы этого не делаем, поскольку все 6 батарей идут параллельно). Дополнительное преимущество промежуточных смесей состоит в том, что в них при одновременном начале пропитывания заканчивается дегидратация. Масло - этот тот же парафин, но с низким молекулярным весом. Помните, как классики рекомендовали: пропитка сначала в парафине с более низкой точкой плавления, а потом в туголпавком? Вот что-то похожее.
Длина протокола подобрана для удобства ручной работы в одну смену, чтобы никого после работы не напрягать перекладками.
Способ 2: Расписание для вакуумного процессора:
ИПА 70% 15 мин при 35оС
ИПА 80% 15 мин при 35оС
ИПА 90% 15 мин при 35оС
ИПА 95% 15 мин при 35оС
ИПА 99.7% 15 мин при 35оС
ИМ 5:1 90 мин при 50оС
ИМ 2:1 90 мин при 50оС
Масло 60 мин при 50оС
Парафин 45 мин при 60оС
Парафин 20 мин при 60оС
Парафин 20 мин при 60оС
Парафин 50 мин при 60оС
Общее время: 7:30.
Меньше уже сокращать нельзя. Весь вопрос всегда состоит в том, когда делать все, то что следует после проводки. Здесь вся загвоздка.
Способ 3: Проводка кусочков в микроволновой печи. Протокол занимает почти 3.5 часа. Этапы ИПА и промежуточных смесей делаются в печке, а все остальное в термостате, поскольку ни масло ни парафин микроволнами не нагреваются. Здесь есть масса всяких тонкостей, и об этом предмете я готовлю статью для журнала.
Сам я пробовал этот метод проводки, результаты вплоне приличные. Однако, главные недостатки состоят в том, что одновременно можно провести всего 12-16 кассет и лаборант должен пару часов "скакать вокруг печи", тратя время только на это мизерное количество кусочков. Все остальные этапы до и после проводки не укорачиваются. Другими словами:
Проводка ткани – это только одна из многих задач в поточной работе в гистологии, занимающая от 3 до 34% общего времени; она зависит от технологии, но все другие задачи не зависят от этого этапа и занимают остальные 66-97%. Это цитата из статьи Rene Buesa (Real impact on the histology workflow of microvawe assiste tissue processing).

3. Для депарафинирования с детергентами желательно обзавестись отдельной водяной баней. Вытяжной шкаф-то зачем?

Возвращаясь к кассетам. Разумеется, если Вы будете при скромном бюджете вы будет их использовать как одноразовые, то Вам никто ничего не купит. Мы используем кассеты многократно. Одной партии из 500 штук хватает на 2.5 - 3 года, потом они плохо защелкиваются - стираются защелки. Кассеты после проводки зпгружаем в кастрюлю с 2% жидкого моющего средства, доводим до кипения, поимешивая и оставляем остывать. Парафин собирается на поверхности. Кассеты промываются, сушатся и потом снова идут в работу. При таком подходе ваша администрация увидит уже через полгода реальную экономию на марле. Кассеты покупали в Биовитруме. Одного одноразового халата для пролкдок в эндоскопии нам хватило почти на год. Ежедневно у нас идет по 15-20 блоков эндоскопий.
Наши лаборанты тоже таскают стулья с участка на участок, поскольку роликов на них нет. Стульям уже почти по 10 лет, сваркоф переваривали их уже по 3 раза.

Добавлено (2010-04-28, 9:31 PM)
---------------------------------------------
Уважаемый Чакона!
И каковы результаты проводки с маслом?

Quote (Чакона)

что, марля+ кубики - это сильно выгоднее? У нас некоторые смешнее работают: проводят в кассетах, а потом... заливают на деревянные кубики... Во, а потом обижаемся обвинениям в лютой консервативности гистологов.

У нас ежедневно режется по 450-500 блоков, и наши лаборанты совсем не в состоянии клеить блоки на кубики. Просто блоки зажимаем в микротом. Уже и зажимы разваливаются, и микротомы на днорских запчастях, а адинимстрации все еще неясно, что для классных срезов нужны классные микротомы.

Вот по финансовым причинам и не можем начать депарафинировать с детергентами. Причина банальна: Для начала нужно купить водяную баню и 80 000 стекол со матовым краем. Тушь с обычных стекол облазит в воде и ососбенно в огрячем мыльном растворе.

Чакона

Дата: Среда, 2010-04-28, 9:38 PM | Сообщение # 47

Полковник

Группа: Патоморфологи

Сообщений: 109

Репутация: 5

Статус: Offline

Quote (Maxim)

И каковы результаты проводки с маслом?

Залил, но все нет времени сесть за микротом - хочется самому посмотреть, что будет, а не спрашивать лаборантку. Для меня принципиально важно посмотреть, как будет резаться хрусталик - при обычной проводке у всех, не только у меня, фул фейл. Кстати, не сказал важной вещи - почему-то мне не удалось добиться нормального смешения аптечного вазелинового масла и ИП даже после суточного стояния при 52 градусах в термостате.

Maxim

Дата: Среда, 2010-04-28, 9:53 PM | Сообщение # 48

Профессионал

Группа: Модераторы

Сообщений: 555

Репутация: 25

Статус: Offline

Quote (Чакона)

как будет резаться хрусталик - при обычной проводке у всех, не только у меня, фул фейл

90:1 хрусталик будет пересушенным. После обнажения поверхности для резки смочите обычной теплой водой примерно 1 минуту, а потом попытайтесь получить верхние срезы. После такого фокуса обычно хороший результат.

Quote (Чакона)

почему-то мне не удалось добиться нормального смешения аптечного вазелинового масла и ИП даже после суточного стояния при 52 градусах в термостате

При смешивании накануне нужно примерно 1 раз в час (в течение рабочего дня) перемешивать промежуточные смеси и перед помещением кассет тоже. Легкая мутность - не помеха. Температуру термостата установите на такую цифру, при которой реальная температура в банках с ИМ будет 50оС. Очень часто имеют место такие несоответствия - не верьте глазам.

Добавлено (2010-04-28, 9:53 PM)
---------------------------------------------

Quote (Чакона)

как будет резаться хрусталик - при обычной проводке у всех, не только у меня, фул фейл

Хрусталик будет пересушенным (это одна из немногих структур, которая пересушивается). После обнажения поверхности для резки смочите обычной теплой водой примерно 1 минуту, а потом попытайтесь получить верхние срезы. После такого фокуса обычно хороший результат.

Quote (Чакона)

Чакона

Дата: Среда, 2010-04-28, 10:01 PM | Сообщение # 49

Полковник

Группа: Патоморфологи

Сообщений: 109

Репутация: 5

Статус: Offline

Quote (Maxim)

Мы используем кассеты многократно. Одной партии из 500 штук хватает на 2.5 - 3 года, потом они плохо защелкиваются - стираются защелки. Кассеты после проводки зпгружаем в кастрюлю с 2% жидкого моющего средства, доводим до кипения, поимешивая и оставляем остывать. Парафин собирается на поверхности. Кассеты промываются, сушатся и потом снова идут в работу. При таком подходе ваша администрация увидит уже через полгода реальную экономию на марле. Кассеты покупали в Биовитруме. Одного одноразового халата для пролкдок в эндоскопии нам хватило почти на год.

Реально кошмар... Кассеты мыть...

Так Вы это, даже на кубики деревянные не клеете?!! Как же это... Неужели начальство и тут сметану на говне собирает? Кошмар, кошмар...

Maxim

Дата: Среда, 2010-04-28, 10:08 PM | Сообщение # 50

Профессионал

Группа: Модераторы

Сообщений: 555

Репутация: 25

Статус: Offline

Quote (Чакона)

Так Вы это, даже на кубики деревянные не клеете?!

Если будем клеить, то на это уйдет еще один день после заливки.
Надеюсь, доживем и до тех светлых дней, когда будем заливать на кассеты или кольца. В наши старые харьковские микротомы даже не получается зажать кассету, только блок.
А что Вы удивляетесь, многие лаборатории так же зажимают сами блоки без наклеивания на кубики, особенно, у кого ежедневно режется по 500-1000 блоков. Когда же это делать?
А патанатомия у нас всегда финансировалась по остаточному принципу.

Чакона

Дата: Среда, 2010-04-28, 10:37 PM | Сообщение # 51

Полковник

Группа: Патоморфологи

Сообщений: 109

Репутация: 5

Статус: Offline

Quote (Maxim)

А что Вы удивляетесь, многие лаборатории так же зажимают сами блоки без наклеивания на кубики, особенно, у кого ежедневно режется по 500-1000 блоков. Когда же это делать?

На кафедре и в отделении патанатомии факультетских клиник СибГМУ и в патанатомическом отделении Горбольницы №1 г.Новокузнецка (это где мне удалось довольно долго поошиваться и посмотреть) клеили на кубики и так же весь архив был на кубиках, а в Томском Онкоцентре - так все заливают на кассеты. Микротомы, правда, везде, кроме Онкоцентра - харьковское старье. Ну, так в Онкоцентре и директор, и зав. отделением - не в крутую вареные идиоты.

Добавлено (2010-04-28, 10:20 PM)
---------------------------------------------

Quote (Maxim)

Если будем клеить, то на это уйдет еще один день после заливки.

Пущай выделяют ставки... А то, если так пойти по пути крохоборства - так и не заливать (ведь наступит время, что из-за перегрузки будет некогда и некому!), а просто в восковой цилиндрик и бритвочкой советской... Или канцелярским ножичком... Как В.А.Бец в 19 веке мозги резал...

Добавлено (2010-04-28, 10:22 PM)
---------------------------------------------
Напоминает Задорнова... Кстати, а женские колготки не идут альтернативой одноразовому халату? smile

Добавлено (2010-04-28, 10:33 PM)
---------------------------------------------
А если кусочки не приклеены на кубике - как же вы надписываете (маркируете) такие блоки, отправляя в архив?

Добавлено (2010-04-28, 10:37 PM)
---------------------------------------------
По-моему, Ваш зав. отделением просто фантастический попуститель... Есть момент, когда уступать и работать на мусоре и отбросах просто нельзя, нужно упереться и сказать: либо будет некий минимум в отделении, либо у нас не будет патанатомии! Впрочем, я здесь - плохой комментатор тому, что происходит у Вас там.

Maxim

Дата: Среда, 2010-04-28, 10:49 PM | Сообщение # 52

Профессионал

Группа: Модераторы

Сообщений: 555

Репутация: 25

Статус: Offline

Quote (Чакона)

А если кусочки не приклеены на кубике - как же вы надписываете (маркируете) такие блоки, отправляя в архив?

номера печатают на компьютере в Excell жирным 18 шрифтом. Этот номер помещают в кассету при вырезке. При заливке номер клеют с тыльной стороны блока. Так блок и хранится в архиве. Стекла, смзанные хромовоквасцовым клеем (сами делаем) подписываются тушью либо после резки, либо перед резкой.

Чакона

Дата: Среда, 2010-04-28, 11:10 PM | Сообщение # 53

Полковник

Группа: Патоморфологи

Сообщений: 109

Репутация: 5

Статус: Offline

Ох, Максим, боюсь, никогда у Вас не будет ни заливочных станций, ни аппаратов для проводки, ни нормальных микротомов... А зачем? Препараты Вашими стараниями получаются превосходно, патологи отвечают в срок, отделение везет, сколько бы не загрузили... Нафига Вашему начальству эти лишние траты на нормальное оборудование и расходники, без которого в Европе не работает уже ни одна захудалая больница, если и так все прекрасно?

Добавлено (2010-04-28, 11:10 PM)
---------------------------------------------
Вот если бы срезы сплошь лепешками шли, да каждой биопсии клиницисты по месяцу дожидались, тогда...

Roman

Дата: Четверг, 2010-04-29, 6:28 PM | Сообщение # 54

Просто профессионал

Группа: Модераторы

Сообщений: 220

Репутация: 7

Статус: Offline

Уважаемый Maxim, большое спасибо за исчерпывающие ответы.
я думал вы уже депарафинируете в моющем средстве. Но если так в Ферри депарафинировать, то стекла перед наклейкой срезов можно обрабатывать яичным белком, не отвалится он вместе со срезом при депарафинировании

От всего человека вам остается часть...
И. Бродский

Maxim

Дата: Четверг, 2010-04-29, 8:59 PM | Сообщение # 55

Профессионал

Группа: Модераторы

Сообщений: 555

Репутация: 25

Статус: Offline

Уважаемый Roman!
Я депарафинирую в фэйри лишь время от времени, пока только гистохимию и совсем редко Г-Э, когда удается добыть стекла, которые подписываются карандашом.
В Белгородском бюро уже несколько месяцев подряд используют такой метод для всех стекол, включая ИГХ.

Тип адгезива может быть любой. Главное, чтобы под срезами не было воды - для этого стекла нужно высушивать сначала хотя бы минут 30 при комнатной температуре, а затем минимум 30 минут при 60оС в термостате (вертикально). Срезы обязательно "облезут", если под ними есть вода или они толстые (такое бывает). Вообще же, нужно проверить это на пробных стеклах. Мы работаем с хромовоквасцовым клеем, который неизмеримо дешевле яичного белка и делается проще. Полилизин конечно, надежнее белка и хромового клея. Однако, есть еще такой надежный адгезив для "проблемных" срезов, как ПВА.

Чакона

Дата: Пятница, 2010-04-30, 5:56 AM | Сообщение # 56

Полковник

Группа: Патоморфологи

Сообщений: 109

Репутация: 5

Статус: Offline

Остается только поставить в отделении наждачный станок и делать шлифы самим... Если уж кассеты моете, и времени на это хватает (дичь; все одно, как кипятить одноразовые шприцы) - то такое кустарное "нововведение" вряд ли кого-то поразит. surprised

Это я все, уважаемый Максим, не к тому, чтобы делать круглые удивленные глаза - а чтобы возразить против этой вот Вашей неверной рекомендации

Quote (Maxim)

Разумеется, если Вы будете при скромном бюджете вы будет их использовать как одноразовые, то Вам никто ничего не купит.

Вроде и в журналах приличных печатаетесь, а такую совковую психологию пропагандируете... Марлю, мол, экономим... А еще можно бумажные фильтры стирать!
Вот я и говорю - не быть у Вас Лейке...

Мой бывший томский шеф на такое однозначно отрезал - я себя перестану уважать, если начну мыть кассеты!

Добавлено (2010-04-30, 5:22 Am)
---------------------------------------------
И почему-то не думаю, что ему легче добиться денег на кассеты...

Добавлено (2010-04-30, 5:56 Am)
---------------------------------------------
Именно кассеты хороши, чтобы начать приучивать тупых самодовольных клиницистов к мысли, что патан - весьма дорогое дело и объедками бюджета его питать нельзя.

Maxim

Дата: Пятница, 2010-04-30, 6:16 AM | Сообщение # 57

Профессионал

Группа: Модераторы

Сообщений: 555

Репутация: 25

Статус: Offline

Уважаемый Чакона!
Я вплоне согласен с тем, что если вещи одноразовые, то использовать их нужно по назначению.
Однако, есть целый ряд обстоятельств, против которых иногда идти не получается, даже при всем желании.
Редко встречаются подчиненные, которые были бы довольны политикой своего начальства на 100%, а еще реже бывает руководитель, который ведет верной дорогой.
Из любой ситуации нужно извлекать разумную пользу.
Стремеление к безопасности в моей лабортории выросло на фоне отвратительного финансирования и мерзких условий труда. (Сейчас, конечно, уже кое-что исправляется)
Тем не менее, я благодарен руководству, что оно не вмешивалось в идею смены реагентов и перестройки всей нашей технологии.
Разумеется, такого рода рекомендации, как мытье одноразовых кассет призваны помочь тем, кто хочет двигаться дальше, но находится под прессингом финансовых обстоятельств и менеджмента. Вы же видите, что у них твориться! А им нужно выжить.
Все мы рано или поздно будем работать так как положено, но движение вперед будет осуществляться в каждом конкрентом случае по-разному. И дай бог, чтобы бестолковые руководители оставляли свои посты раньше, чем специалисты, ибо последние всегда в меньшинстве.
В последнем случае будет труднее возродить услугу, чем перестроить способ управления предприятием.
Поэтому, мои рекомендации адресованы чаще не тем, у кого все хорошо, а тем, кто плывет против мощного потока в одиночку.

Чакона

Дата: Пятница, 2010-04-30, 3:47 PM | Сообщение # 58

Полковник

Группа: Патоморфологи

Сообщений: 109

Репутация: 5

Статус: Offline

Ну, хорошо.
Расскажите, как заливаете - как при таком большом объеме материала сохраняете заливочный парафин жидким (помниться, по опыту ручной заливки - это самый геморрой: парафин в кувшине стынет с потрясающей быстротой!), пользуетесь ли холодильником или водой для быстрого охлаждения блоков, заливаете ли в формы (стальные, вряд ли при таком объеме - в бумажные) или в чашки Петри, а потом - вырезаете? Может, и тут у Вас есть какие полезные рационализации?

У нас стоит заливочная станция Leica, пожалуй, самый нужный гистологический девайс - без аппарата-пропитчика обойтись сравнительно легко, без аутостайнера - тоже, про автомат для заключения я не говорю даже. Но эта машина действительно облегчает жизнь лаборантов на порядок. Заливка идет на нагревательном столике, в специальные многоразовые железные формы (ничем не смазываем - и так хорошо отстают), для нагрева кассет и форм имеются отдельные резервуары. Легким движением руки или ноги парафин из горячей ванны направляется в кран и наливается в форму, кусочек ориентируется, сверху накладывается подписанная кассета в качестве колодки-кубика и форма сразу же переносится на заледенелую охлаждающую платформу (только нужно не забыть через минуту его перевернуть кассетой вниз - а то от быстрого охлаждения блок легко трескается). В один блок у нас помешается 5-7 кусочков, так что все образцы от одной мыши вполне умещаются на 2-3 блоках (срезах).
Железные формы есть разные - от совсем маленьких, для объектов типа яичников или надпочечников - до специальных сборок под крысиные и кроличьи глаза. Последние, впрочем, все же чаще заливаем в чашках Петри.

Добавлено (2010-04-30, 3:47 PM)
---------------------------------------------
Да, и каким парафином пользуетесь?

Maxim

Дата: Пятница, 2010-04-30, 4:53 PM | Сообщение # 59

Профессионал

Группа: Модераторы

Сообщений: 555

Репутация: 25

Статус: Offline

Часть рассказа видна на приложенном фото. Сделано было в 2006 году, когда работали на марле еще. Сейчас все в кассетах.
Уголки выстраиваем в ряд, и потом заливаем. Основной запас парафина для заливки все время грееется в отдельном термостате в фрафоровых 3 л стаканах. До этого был обычный парафин с точкой плавления 56оС + 5% пчелиного воска (видите, блооки желтоватого оттенка?). Позже переключились на добавку 5% базисного стоматологического воска. Сейчас для заливки используем гистомикс. Основной запас разливаем по более мелким фарфоровым стаканам, или 100 мл стеклянным стаканам и из них заливаем блоки (парафин застывет немного в верхних частях стаканов, но заливке это не мешает). В процесс заливки используем спиртовку для подогрева пинцета. Заказали своим друзьям электрикам,чтобы они сделали пинцет с электроподогревом, но что-то у них не ладится. Отдельно такие пинцеты не продаются ни в Leica, ни в Shandon.
Основной инструмент для нагрева парафина при заливке - старинный мармит, советского производства. В центре мармита обычно ничего не ставим (там основной нагрев), все располагаем по краям, где температура не превышает 62-64оС. После заливки второго ряда по 21 блоку первый разбираем. Блоки освобождаем от форм (как правило через 20-22 минуты), срезаем ненужные хвосты парафина и помещаем в молрозилку минут на 10-15, где они затвердевают. Затем раскладываем по номерам. Предварительно лицевую часть не срезаем. Обычно заливают 2 или 3 человека. 6 банок по 35-40 кассет заливают за 2 часа (если двое, и быстрее, если трое).
В один блок заливаем только по одному кусочку. Также срезы с каждого блока помещаем только на одно стекло (если нет доп. окрасок). Один кусочек - один номер - один блок - одно стекло.
Формы после заливки слегка подогреваем на мармите и потом вытираем сухой ветошью (это делают санитарки).
Наша скорость заливки близка к среднему значению хоронометража этой операции, проведенного в 241 лаборатории со всего мира. 1 минута = 1 блок (при ручной заливке).

Прикрепления: 8886974.jpg (133.0 Kb)

Roman

Дата: Пятница, 2010-04-30, 7:04 PM | Сообщение # 60

Просто профессионал

Группа: Модераторы

Сообщений: 220

Репутация: 7

Статус: Offline

Уважаемый Чакона, нет можно сказать сил объяснять вам положение медицины вообще и патанатомии в частности в России за пределами МКАД, не считая может быть некоторых крупных городов. В одном из районов морг и женская консультация находится в одном здании. В нашем отделении косметического ремонта не было лет 15-20, дверь, через которую покойников выдают, держится на трех ржавых гвоздях, вбитых в две гнилых доски. А вы говорите заливочная станция. Не хотите: металлические тюбики из-под зубной пасты режутся на полоски сворачиваются в кольца и так заливаются соскобы в чашках Петри, еще бумажечка с номером сверху прикрепляется. У кого денег просить, у главного врача больницы, где аппараты ИВЛ такой же давности как и наш косметический ремонт, электрокардиограф работает с перебоями. Да у нас в патанатомии дела еще получше, чем в клинической лаборатории.

Добавлено (2010-04-30, 7:04 PM)
---------------------------------------------
Уважаемый Maxim, еще одна деталь пришла в голову. Надо ли промывать материал после фиксации для изопропаноловой проводки. В своей практике мы не промываем.

От всего человека вам остается часть...
И. Бродский