Вы вошли как Гость
Текущая дата: Пятница, 2024-04-26, 5:43 PM
|
Проводка и заливка
|
|
| danilsafronov92 | Дата: Суббота, 2020-02-01, 9:59 PM | Сообщение # 601 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 4
Статус: Offline
| Maxim, спасибо большое за подробное объяснение. Да, на кафедре. Но под руководством не во всем до конца разбирающихся людей. Сейчас ознакомливаюсь с литературой, пытаюсь найти людей, кто работал в таком направлении. Пока разбираюсь сам. Буду держать в курсе!
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2020-02-01, 11:09 PM | Сообщение # 602 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Понятно. На кафедрах, естественно, каждый занят своими направлениями.
Хорошо, но для получения более-менее понятной картины о проводке таких объектов есть смысл покопаться в специфических статьях в Journal of Histotechnology и Biotechnik&Histochemistry, а также в специализированных журналах по ихтиологии.
|
| |
| |
| YarG | Дата: Пятница, 2020-04-03, 10:34 AM | Сообщение # 603 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 4
Статус: Offline
| День добрый. Ситуация такая: лаборатория доклинических исследований. С животных берут комплект органов, а делать сортировку по типам нет возможности (слишком много и животных и органов). Протокол исторически сложился следующий (не знаю от куда он взялся, но работает), проводка ручная: вырезка - изопропил 80% ночь - изопропил 90% 30 минут - изопропил 90% 30 минут - изопропил чистый 60 минут - смесь парафин-изопропил 60 минут - парафин 60 минут. В принципе результат приемлем, но хочется лучше. Ткань слишком сжата по краям, ядра уплотнены, лимфоидная печально. Еще проблема, которая не решаема из-за загруженности - фиксация в 10% формалине длительная (может и неделю постоять и больше), при вырезке толщина до 3-4 мм.
Какие есть советы?
Сообщение отредактировал YarG - Пятница, 2020-04-03, 10:47 AM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2020-04-03, 11:42 AM | Сообщение # 604 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| YarG, не увидел в протоколе проводки этапа промывки водой - полезный очень.
4 мм на вырезке многовато, это материал достаточно сложный, нужно не толще 3 мм делать.
Я бы еще добавил один ИПА на 1 час чистый.
+ 3 парафина по 1 часу.
|
| |
| |
| YarG | Дата: Пятница, 2020-04-03, 11:44 AM | Сообщение # 605 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 4
Статус: Offline
| Maxim, спасибо попробую. Промывка после ночи?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2020-04-03, 11:48 AM | Сообщение # 606 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| YarG, да, после фиксации, перед проводкой 1 час в проточной воде. Кассеты пошевеливать.
|
| |
| |
| YarG | Дата: Пятница, 2020-04-03, 1:20 PM | Сообщение # 607 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 4
Статус: Offline
| По физике процесса не очень понял: что делает промывка, и если добавить еще ИПА, то он же еще больше уплотнит материал (или нет?). Или если градиент спиртов сделать более плавным: 70 (ночь)-80-90-90-100, по идее это будет более щадяще убирать воду.
А еще вопрос: как долго может стоять в последнем парафине? С увеличением времени, на заливку уже времени не останется.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2020-04-03, 6:24 PM | Сообщение # 608 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| YarG, промывка убирает фосфатный буфер и остатки непрореагировавшего формалина с тканями. Фосфаты образуют со спиртами нерастворимые соединения, поэтому их нужно убирать, иначе будет все плохо резаться, ведь ткани грызунов содержат мало воды и проблемные в микротомии.
Плавные переходы спиртов будут образовываться сами собой при постоянной смене спиртов: первый выливается, на его место второй и т.д., а последний чистый. И это нужно делать для каждой партии кусочков. Но вода не самое главное, она легко убирается. Важнее жир, его трудно убрать, поэтому кусочки должны быть чем тоньше, тем лучше.
По парафинам лучше не передерживать. Так как у вас нет никакой компромиссной промежуточной среды (а для отличной проводки она все же настоятельно рекомендуется), то организуйте процесс работы так, чтобы кто-то пришел на работу позже и задержался на заливку. Других вариантов здесь не вижу.
|
| |
| |
| YarG | Дата: Суббота, 2020-04-04, 1:38 AM | Сообщение # 609 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 4
Статус: Offline
| Maxim, А! Про промывку не понял сразу. После формалина, конечно, промываем.
Последний вопрос тогда: промежуточная среда - ксилол или минеральное масло? Он смешивается с парафином (1:1?) и в нем можно оставить на ночь? Одна смена?
Масло безопаснее, но его увы не используем. Как я понимаю для начала подойдет обычная веретенка И20, если пойдет - вазелиновое. Но это времязатратнее, чем с ксилолом, т.к. 2 промежуточные а потом масло? Или можно сократить?
Если не затруднит - опишите варианты (описывают протоколов много, но в этом и проблема - глаза разбегаются, а понимания нет).
И спасибо Вам большое!
Сообщение отредактировал YarG - Суббота, 2020-04-04, 2:12 AM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Воскресенье, 2020-04-05, 9:38 AM | Сообщение # 610 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| YarG, ксилол можно смешать с парафином 1:1 и оставить до утра в термостате 37оС. Это самый крайний случай, если нет других реактивов.
В лучшем случае для грызунов будет гораздо лучше использовать метод с изопропанолом и минеральным маслом, где есть 2 смеси и масло. В масле вообще без вреда можно оставлять на любой срок, хоть на месяц, не опасаясь избыточного уплотнения объектов.
Масло И20А было актуально раньше (минус этого масла в том, что смеси работают только при 50оС не меньше и это не очень благоприятно для трудных тканей грызунов), а сейчас имеются вполне пригодные промышленно выпускающиеся смеси и минеральное масло.
В ЛС можем обсудить подробности.
|
| |
| |
| tshevhenko87 | Дата: Четверг, 2020-11-19, 4:26 PM | Сообщение # 611 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 10
Статус: Offline
| здраствуйте! Подскажите пожалуйста, кто красит по методике Майера. Сколько хранится этот реактив и при каком температурном режиме? Через сколько нужно заменить реактив? Приготовили новый реактив перестал браться к срезам гематоксилин(в кабинете стало холодно может быть из-за этого).
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2020-11-19, 5:30 PM | Сообщение # 612 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Цитата tshevhenko87 (  ) в кабинете стало холодно может быть из-за этого.
Парафин не убирается если меньше 20оС.
|
| |
| |
| tshevhenko87 | Дата: Четверг, 2020-11-19, 6:34 PM | Сообщение # 613 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 10
Статус: Offline
| Спасибо за ответ. Как выйти из этого положения? Можно ставить ксилолы и спирты в термостат 37С?И ещё у нас реактив изменил цвет?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2020-11-19, 8:02 PM | Сообщение # 614 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Тепло в комнате сделать - в термостат не набегаешься с этими контейнерами. И красители холод не любят тоже. Чисто технически неудобство громадное - бегать в термостат.
А какой реактив изменил цвет? Какой был и какой стал?
|
| |
| |
| tshevhenko87 | Дата: Четверг, 2020-11-19, 9:32 PM | Сообщение # 615 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 10
Статус: Offline
| У нас комната для покраски большая с 2-мя вытяжками её нам никто обогревать не захочет, но в этой комнате есть термостаты. Я про реактив Майера-что он был фиолетово-красный, а стал коричневым. Я думаю проблема, что этот реактив наверное нужно чаще менять, в нем как вроде не осталось гематоксилина(я прочитала Вы там писали, что через 100 стекол, а у нас прошло больше - и спросить не у кого).
|
| |
| |
|
|
