Вы вошли как Гость
Текущая дата: Понедельник, 2024-04-29, 7:28 AM
|
Проводка и заливка
|
|
| SOVA | Дата: Среда, 2011-07-06, 6:29 PM | Сообщение # 256 |
 Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 81
Статус: Offline
| Приветствую, уважаемый Maxim и коллеги!
Благодарю за ответ. Конечно, смеышленный сотрудник это находка. А как тогда быть, когда есть уже сформировавшиеся лаборанты, но еще молоды в возрасте, до 40. Для них трудно менять то , что устоялось, вросло, окрепло. Но этот год для нашей лаборатории ознаменовался февральской революцией! Именно тогда я впервые вышла на этот форум. Есть серьезные и радикальные перемены, но главное есть перемены к лучшему. Но идеал еще так далек.!!!!! Для сотрудников врачу нужно стать авторитетом, что бы они послушали и пошли за тобой. А это ой как сложно.
На днях отметила такую тендецию в окраске среза, и сломала ум, чего опять вылетело? Прежде всего погрешили на ксилол и неадекватную депарафинизацию, но почему такая неровная граница цвета? Обезвоживание? Причему это определенно по краям стекла?. Окраска проходи в автостейнере, сткло погружется глубоко в реагентику. Дорогие коллеги, приношу извинения за нашу ограниченность, но без Вашего совета нам не обойтись!
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2011-07-07, 6:42 AM | Сообщение # 257 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Sova!
Проверьте качество обезвоживающих спиртов перед ксилолом (перед заключением). Рекомендую сделать 4-5 позиций спиртов. Через каждые 4 партии препаратов первый вылить безжалостно, остальные передвинуть на одну позицию влево. Последний свежий. Никаких там разведений, наподобие 70% и прочее. Все это асболютно лишние вещи. Этанол самый худший по качеству обезвоживания. Изопропанол - лучше, еще лучше ацетон (но тут нужно хорошо вести журнал преурсоров и соблюдать меры пожарной безопасности).
Черные пятна - это отсутсвие просветляющего эффекта ксилола. Этот эффект не наступает, если в срезе остается вода. Вода - полярный реагент, ксиол - неполярный. Спирт - умеренно полярный. Именно поэтому он смешивается и с водой и с ксилолом.
В просветленных участках также не видно четкости окраски структур. Гематоксилин смазанный. Похоже, что либо большая концентрация кислоты в дифференцирующем гематоксилин растворе, либо слишком мало время промывки после дифференцировки. А подсинивающего раствора вообще нет. Исправьте эти моменты и вы сразу почуствуете качество.
Эти самые стекла можно исправить: убрать среду для заключения, последовательно вернуть через ксилолы и спирты в воду, докрасить гематоксилином и далее снова по протоколу. Все исправится - увидите сами.Добавлено (2011-07-07, 6:42 Am)
---------------------------------------------
Ат аткже, если вы посмотрите на представленные стекла не в микроскоп, а макро, подложив черный фон, то увидите белые участки там, где под микроскопом черные. Это еще один признак недообезвоженных стекол.
|
| |
| |
| SOVA | Дата: Четверг, 2011-07-07, 6:30 PM | Сообщение # 258 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 81
Статус: Offline
| Уважаемый Maxim! Спасибо! Если не трудно, напомните, чем Вы посиниваете? Гематоксилин у нас созревает на квасцах. кислота капается в эозин по Вашей рекомендации.Я видимо упустила момент дифференцировки. Из чего он состоит?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2011-07-07, 10:35 PM | Сообщение # 259 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Нижен фрагмент окраски гематоксилином и эозином, как он выполняется у нас:
Гематоксилин Lillie, 5 минут
Промыть в водопроводной воде 3 смены по 1 минуте или до чистой воды
Дифференцировка: 0.5-1% солянокислый 70-96%спирт (можно водный раствор соляной или уксусной кислоты) несколько маканий. Определить нужное количество опытным путем.
Промывка 2 смены воды из-под крана х 1 минута.
Подсинивание:
Вода из-под крана 5-10 минут или
вода с 1 каплей концентрированного аммиака на каждые 100 мл воды или
фосфатный буфер с рН 7-8 или
любой другой буферс рН 7-8 или
любой другой подсинивающий раствор (углекислый литий, вода Скотта, вода с кусочками мрамора)
Любой мз реагентов применяется до тех пор, пока ядра и весь срез будут синими, без оттенков красного цвета.
Промывка в дистиллированной воде, 1 смена х 3 минуты
Эозин.
Первые результаты определяются опытным путем и требуют контроля под микроскопом. Позже, лаборанты это делают автоматически, если нет изменений в составе реагентов.
Лучшие котнроли для Г-Э - апендикс и плацента.
Если в срезах останется кислота: будут красные ядра, мутное изображение
Если остается щелочь: нет эозина.
В ксилоле все реакции прекращаются, поскольку ксилол среда неполярная. Так и сохраняются срезы годами, лишь выцветая под действием дневного света.
Еще думаю, что если на этапе депарафинирования грязны1 ксилол - он не удаляет часть парафина и стекла остаются не окрашенными, но это водно четко в нижнем крае срезов, поскольку парафин медленно стекает вниз среза.
|
| |
| |
| SOVA | Дата: Пятница, 2011-07-08, 5:46 PM | Сообщение # 260 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 81
Статус: Offline
| Благодарю, нужно будет обмозговать, как приспосбить данную схему к автостейнеру. Есть еще одна загадка. Изредка она выпригивает на стеклах. Эти интересные ядра. Фиксация в буфер-формалине от Оптек.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2011-07-08, 7:33 PM | Сообщение # 261 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Эти ядра также результат некачественного обезвоживания. Забуференный ОПТЭКовский формалин здесь совершенно не причем. Такие фокусы бывают и у нас, когда девчонки протормаживают со сменой растворов. Просто пройдите последовательность до эозина назад (на фото также рН эозина высоковатая: бледноватые элементы, которые должны быть окрашены эозином) и затем снова вперед в чистых реагентах. Все исправится.
Приспособится к стайнеру не так сложно. Главное, иметь хороший запас растворов и вовремя его пооплнять, чтобы не было остановки. Отработайте руками протокол, время и запрограммируйте его в одну из пользовательских ячеек памяти.
Не забывайте вовремя менять реагенты. Наслаждайтесь картинками.
|
| |
| |
| Patannatka | Дата: Четверг, 2011-12-22, 12:34 PM | Сообщение # 262 |
 Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Уважаемый Maxim. У меня есть небольшой вопрос. Если после обезвоживания в спиртах, можно вместо ксилола кассеты перекладывать сразу уайт-спирит, а затем в парафин?
А по поводу биопсийных мешочков, они очень удобны для мелких соскобов (например: соскобов церв. канала). В них просто соскоб выливается, мешочек складываем пополам и он хорошо помещается в кассету. После прохождения проводки мешочек просто разрываем по швам, и спокойно собираем материал. Только так работают мешочки итальянского производства, наши не знаю, но на вид российские убожество и скорей всего разорвать по шву их не получится.
Сообщение отредактировал Patannatka - Четверг, 2011-12-22, 12:41 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2011-12-22, 9:02 PM | Сообщение # 263 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Patannatka!
К сожалению, спирт (этанол) никак не смешивается с уайт-спиритом. Поэтому последовательность может выглядеть либо классически (этанол-ксилол, этанол-хлороформ) или альтернативной (ацетон-ксилол, ацетон-хлороформ, ацетон-уайт-спирит, изопропанол-парафин, изопропанол-минеральное масло). Менее понятные последовательности: изопропанол-ксилол, изопропанол-хлороформ, изопропанол-уайт-спирит.
Мы делали раньше так: сначала 4 этанола по 1 часу, потом 2 ацетона по 30 мин, потом 3 уайт-спирита 2 по 1 часу и последний до утра. Именно то, что в уайт-спирите ткани не твердеют, как в ксилоле, и заставляло нас мириться с отвратным запахом уайт-спирита. Это продолжалось более 4 лет, пока мы не нашли более благоприятные вещи. Ацтеном пользовались потому, что 95% этанол все-таки гадкий дегидратант для гистологии. Так и мирились с его высокой пожароопасностью. Теперь все позади.
Вся идея проводки базируется на том, чтобы перейти от полярных сред (водный раствор формалина) к неполярным (парафин). Промежуточные звенья (спирты и углеводороды) призваны обеспечить этот переход. Но при этих переходах мы должны убрать не только воду из кусочков, но и жиры, которые не фиксируются формалином вопреки мнению, что формалин является фиксатором для жира. Формалин фиксирует мембраны, а не жир. И если жир не удалить просветлителями, то пропитывание парафином будет безуспешным. Отсюда и все трудности в микротомии и т.д.
Я не спорю насчет удобства биопсийных мешочков, особенно импортных - цена кусается сильно. Поэтому до сих пор не оставил идею о том, что должно быть что-то дешевле биопсийных мешочков.
|
| |
| |
| Patannatka | Дата: Суббота, 2011-12-24, 10:29 PM | Сообщение # 264 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Уважаемый Maxim! Спасибо, за консультацию. На днях решила попробовать Ваш способ проводки ИПА+масло+парафин. Надеюсь все получится.
Только у нас старый термостат и диапазон температур "гуляет" в пределах 3-4 градусов, можно изопропанол+масло нагревать до 52-54 градусов, или строго 50 градусов?
Сообщение отредактировал Patannatka - Суббота, 2011-12-24, 10:37 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Воскресенье, 2011-12-25, 7:43 AM | Сообщение # 265 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Patannatka!
Настройте термостат на 52оС, сделайте смеси, поставьте их в термостат днем или вечером и утром взоблтайте их. Если не будет расслоения на масло и изопропанол - все хорошо. Проверьте температуру в банке с реактивом термометром. Цифра 50 не абсолютная, могут быть отклонения, но обычно выше 53-54оС нет необходимости нагревать их. Мы всегда готовим промежуточные смеси вечером, чтобы до 13 часов следующего дня они прогрелись как положено - у нас 18 банок (по 6 каждой смеси и масла) смотрите приложение. С утра идет обезвоживание в спиртах, во второй половине дня и до утра пропитывание в смесях и масле. На следующий день - пропитывание парафином с 8 до 12 часов.
Для масла И-20А достаточно 50оС. Обычно в старых маслянных термостатах типа ТС-80 нагрев стабильнее на нижней полке и ближе к стенке. Также проверьте, нет ли утечки тепла через прокладки на дверцах. Прокладки доступны в любой фирме, занимающейся ремонтом холодильников. В совсем старых моделях термостатов, где внутренняя стеклянная дверца защелкивается, я приклеивал резиновые самоклеящиеся прокладки, которые ставят на обычные двери. Они продаются в любом строительном магазине за копейки.
Будет интересно узнать результаты Ваших проб.
|
| |
| |
| Patannatka | Дата: Четверг, 2012-01-19, 1:56 PM | Сообщение # 266 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 3
Статус: Offline
| Уважаемый Maxim! Ваш метод проводки с маслом прошел "на ура". Материал резался отлично. Спасибо за информацию. Я рассказала лаборантам в соседнем районе, там очень заинтересовались. Только в наличии у них только один термостат, который держит температуру 60 гр. (для парафина). Закупка второго термостата для нагревания смесей и масла исключена. Можно ли в этом термостате одновременно проводить смеси, масло и парафин, т.е. все эти жидкости нагревать до одной температуры 60 гр. Не испортит ли это проводку? Если это исключено, то будет очень жаль.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2012-01-19, 9:34 PM | Сообщение # 267 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Patannatka!
Очень рад вашим успехам. Наслаждайтесь на здоровье.
Положение у ваших коллег не завидное. Пусть, конечно, попробуют провести все в термостате 60оС, если другой возможности нет (паралельно имеет смысл поискать неиспользуемый термостат в других лабораториях, пусть даже клинических и любым образом договориться заполучить его себе или во временное пользование, или передачей с баланса на баланс или как-то иначе, способов масса).
Думаю, что при такой температуре прийдется подгонять расписание под их специфические возможности. Здесь просто нужно попробовать.
Я бы сделал так:
1. Этапы с изопропанолом оставить без изменения, а промежуточные смеси уменьшить до 1 часа каждая при 60оС. Затем перенести кассеты в масло, которое тоже должно стоять в этом же термостате хотя бы 1 час при 60оС. Если начинать в 8 утра, то до 16 часов это выполнимо.
2. Как я понимаю, пропитывание парафином они все равно будут делать на следующее утро, а значит либо через час, либо сразу после переноса в масло эту банку выставить из термостата и оставить до утра касеты в масле при комнатной температуре. Утром дать ибытку масла хорошо стечь и перенести кассеты в расплавленный парафин и этапы с парафином оставить без изменения, 4 х 1 часу при 60оС. Банку с маслом после перекладки кассет в парафин снова поставить в термостат, и до часа дня она нагреется (банка с маслом должна быть как можно дальше от банок с парафином, чтобы последний не застыл).
3. Не забывайте про своерввременное обновление реагентов и накрывание металическими крышками стеклянных евробанок с промежуточными смесями. При такой температуре изопропанол из открытых банок очень хорошо испаряется и может понадобиться долив изопропанолом (масло не испаряется!). Масло и парафин должны быть без крышек - здесь необходимо, чтобы испарялись остатки изопропанола.
4. При перекладывании в промежуточные смеси и масло очень осторожно открывать банки и термостат - обязательно будет поток неприятного горячего изопропанола в течение нескольких секунд. После перекладывания обязательно провертивайте помещение!
Для начала желательно провести пробные прогоны, чтобы утвердить нужное время. Если заведомо имеется материал, который будет подвергаться ИГХ, необходимо проверить на всех маркерах (это громадная работа) и заручиться согласием патогоа, который будет оценивать результаты ИГХ. Для обычных простых случаев ущерба быть не должно также. В любом случае такой эксперимент будет интересен очень многим людям и нам бует важно знать о его результатах.
Если будут трудности, пишите, попробуем справиться.
|
| |
| |
| Karen | Дата: Воскресенье, 2012-01-22, 2:56 AM | Сообщение # 268 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Максим, огромное спасибо за подробное описание проводки с изопропанолом и маслом! Я работаю в науке и очень не хотелось связываться с ксилолом т.к. помещение совершенно не приспособлено, вытяжки нет и т.п. Изопропанольный метод очень понравился, работает на нашем материале, в том числе на образцах хранившихся много лет в формалине или спирте.
Один вопрос. Вы пишите, что не до конца избавились от ксилола, который все равно используется для заключения препаратов. Я обнаружил, что пихтовый бальзам хорошо растворяется в изоропаноле. Попробовал использовать вместо обычно используемого раствора пихтового бальзама в ксилоле. Разницы не увидел. После окраски я сейчас вместо этанола переношу стекло сразу в изопропанол, а затем сразу бальзам (пихтовй быльзам растворенный в изопропаноле). Ксилол не используется вообще.
Как Вы думаете, могут ли быть какие негативные последствия от применения для заключения препаратов бальзама на изопропаноле? Мне важна длительная сохранность препаратов.
Сообщение отредактировал Karen - Воскресенье, 2012-01-22, 2:58 AM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Воскресенье, 2012-01-22, 2:29 PM | Сообщение # 269 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый Karen!
Совершенно правильно, канадский и пихтовый бальзам растворяются как в ксилоле, так и в спирте.
Если помните, спиртовой (вероятнее всего этанольный) раствор канадского бальзама используется для приклеивания линз в конденсоре, окулярах и объективах микроскопа. Поэтому линзы лучше не очищать ни спиртом ни ксилолом.
Сравните коэффициенты преломления:
Изопропанол 1,3776 ИПА,
О-ксилол 1,5054 ,
Канадский (пихтовй бальзам) 1,54,
Глицерин - 1, 473.
Поэтому раствор бальзама в ксилоле считается лучшей средой для заключения. Тем не менее, длительное высыхание бальзама является серьезным препятствием для использования при работе с большим объемом материала. Поэтому и были предложены синтетические среды, такие как полистиролы и акрилаты. Они имеют практически ткаой же коэффициент преломления, но высыхают несравненно быстрее бальзама.
Все же, в канадском бальзаме плохо сохраняются некоторые гистохимические окраскии что-то из ИГХ. Да и стоиомсть его достаточно высока при пересчете на большие объемы и выпускается его гораздо меньше, чем полистирола, поэтому он обречен на вымирание на рынке.
На мой взгляд, достаточно компромисной штукой может стать следующая: после окрасок серия изопропанолов для хорошего обевоживания, затем высыхание препратов на воздухе досуха и заключение в полистирол под стекло. На несколько секунд можно смириться с наличием ксилола в среде для заключения. В крайнем случае место для заключения, где есть ксилол, можно оборудовать и вытяжкой.
Я тоже поробую растворить пихтовый бальзам в ИПА в экспериментальном плане. Напишу о своих впечатлениях.
|
| |
| |
| Karen | Дата: Воскресенье, 2012-01-22, 3:24 PM | Сообщение # 270 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Уважаемый Максим! Спасибо за быстрый ответ. То есть серьезных препятствий нет, кроме несколько худшего коэффициента переломления. Визуально препараты меня устраивают, так что это приемлимо, а объемы небольшие, режу только для себя. Раствор бальзама в изопропаноле, должен иметь какое-то среднее значение и повышаться со временем по мере испарения изопропанола.
Сушить, как Вы уже рекомендовали раньше, я пробовал, потом каплю бальзама (на ксилоле) и под стекло. Получалось хорошо.
Кстати, а вот отмывка парафина моющим средством не пошла, периодически стали выпадать определенные ткани, возможно это специфика наших объектов (отклеивалась и выпадала мезоглея на препаратах кишечнополостных животных).
|
| |
| |
|
|
