Вы вошли как Гость
Текущая дата: Понедельник, 2024-04-29, 4:19 AM
|
Проводка и заливка
|
|
| Maxim | Дата: Воскресенье, 2012-01-22, 7:37 PM | Сообщение # 271 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Karen!
Разумеется, ваши результаты с заключающей средой будут интересны многим участникам этого форума.
Что касается метода депарафинирования с моющим средством, здесь важно чтобы перед депарафинированием срезы очень хорошо высохли. Как я понял, время для этого достаточно. Сушите в термостате 37оС до утра и перед депарафинированием 30 мин при 60оС. Только в стойках и вертикально, а не горизонтально на нагревательных пластинках.
Если откливаются срезы, используйте адгезивы (белок, хоромовокавсцовый клей, полилизин, плюс-стекла). Ведь при ИГХ срезы не облазят со стекол даже в буферах с высокой рН при варке в микроволновках, банях, автокалавах в течение десятков минут (если все правильно сделано)!. Пробуйте еще, обязательно получится.
|
| |
| |
| Karen | Дата: Понедельник, 2012-01-23, 9:31 AM | Сообщение # 272 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Да, именно так и делал, сушка в термостате, вертикально, стекла чем только не мыли, хромовой смесью в том числе, покрыты хромоквасцовым клеем. Плюс стекла по 800р пачка для нашего института неподъемная цена. Думаю проблема все таки в специфике нашего материала, срез актинии (морские анемоны), стенка тела состоит из двух слоев эпителия и между ними толстая мезоглея (неклеточный матрикс). Вот эта мезоглея и выпадает, полностью или частично. Пока я депарафинизирую в последовательности уайт-спирит->ацетон->вода, а сейчас вместо ацетона буду в изопропанол класть после уайт-спирита, (пока не пробовал).
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2012-01-23, 10:50 PM | Сообщение # 273 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Karen!
Здесь есть одна тонкость. Мезоглея - это тот же коллаген, т.е. рыхсая соединительная ткань. Она не любит сильного обезвоживания и после проводки может напоминать основное вещество кости человека - такая капризная штука, благодаря которй срезы костей зачастую прекрасно облазят со стекол.
При проводке не нужно сильно обезвоживать ткань актиний.
Второй фокус мне иногда помогал. При депарафинировании после последнего уайт-спирита просто дайте высохнуть срезам. Затем обезжирьте их в ИПА и потом красьте как необходимо. Ацетон обычно очень жесткий для этих целей. Клей - хромовоквасцовый.
Сушка стекол, как делаете.
Я этот вопрос задал моим друзьям, они имели дело с морскими объектами. Как ответят - перешлю.
|
| |
| |
| Karen | Дата: Воскресенье, 2012-01-29, 5:40 AM | Сообщение # 274 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| "Не надо сильно обезвоживать при проводке" - это означает сократить время проводки по банкам с изопропанолом?
У меня сейчас проводка такая:
5 ИПА по 1 часу в каждом,
2 ИПА+масло (5:1 и 2:1) 1.5 часа,
масло и парафины.
Вроде бы здесь писали, что даже длительное нахождение в ИПА не вредит (в отличие от этанола)?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Воскресенье, 2012-01-29, 10:54 AM | Сообщение # 275 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Karen!
Этот протокол был разработан для хирургических образов тканей человека.
Если приходится иметь дело с тканями грызунов (мышей, крыс), кошек и собак, то время в ИПА можно сократить вдвое на каждой станции, а смеси по 1 часу. Масло и парафины можно оставить без изменения. В этих тканях меньше воды и
Идея проводки состит в том, чтобы осуществить последовательный переход от полярного формалина (любые водные растворы) через малополярные спирты и довести их до неполярного парафина. Если все сделано правильно, то подавляющее большинство химических реакций, происходящих в проведенных кусочках будут прекращены. Это позволяет хранится тканям десятки лет в парафиновом блоке.
Если ваши объекты отличаются от человеческих и есть проблемы в микротомии, отрегулируйте свой протокол.
В тканях обычно не так много воды, сколько нам кажется. И при обезвоживании из тканей удалется несвязанная вода. Тут ткани немного уплотняются, заодно и восстанавливается их естественный цвет. Если обезвоживание продолжить, то начнет удаляться связанная вода и ткани переуплотняются. При резке они крошатся. Особенно это заметно на богатых кровью тканях. Изопропанол также удалет часть жира из тканей. Масло также замещает оставшуюся часть жира. Затем парафин начинает замещать масло. Если жир останется в тканях, то парафин не заместит масло и жировые ткани будут плохо резаться на микротме.
Мы много раз оставляли разные ткани до утра и до понедельника в банках с ИПА. Ничего с ними не происходило. Во всякмм случае ИГХ-реакции не страдали и микроскопическая картина абсолютно не страдала. Конечно, соскобы были пересушены, но при микротомии мы помещали на блок кубик льда на 1 минуту и затем делали срезы. Они получались отлично после смачиваня. В большом потоке нет возможности посвящать каждому блоку много времени и поэтому лучше период обезвоживания не увеличивать. За рабочий день руками весь процесс проводки не получается закончить - когда-то нужно еще и залить проведенные ткани. Поэтому необходим перерыв до утра. Здесь спасает масло как очень нейтральная среда.
|
| |
| |
| Pesikot | Дата: Вторник, 2012-01-31, 9:19 PM | Сообщение # 276 |
|
Рядовой
Группа: Проверенные
Сообщений: 6
Статус: Offline
| Quote (Maxim) Если приходится иметь дело с тканями грызунов (мышей, крыс), кошек и собак, то время в ИПА можно сократить вдвое на каждой станции, а смеси по 1 часу. Масло и парафины можно оставить без изменения.
Сегодня попробовала Ваш метод как раз с тканями крысы, и не очень довольна результатом. По схеме указанной выше, т.е. с спиртах по часу и тд. Правда смесь изопропанол-вазелиновое масло 2:1 так до конца смешалась. Уважаемый Maxim, насколько этот момент принципиальный?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Среда, 2012-02-01, 9:00 PM | Сообщение # 277 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Pesikot!
Ian Montgomery из университета Глазго успешно использует описанную в моем предыдущем сообщении модификацию метода с маслом уже много лет. Он получает ЛЕНТЫ срезов тканей грызунов толщиной 2мкм без особых трудностей.
Этапы с парафином такие: 2 х30 мин и 2 х 20 мин.
Прозрачность смесей принципиальна: никакого расслаивания смесей. Сделайте их вечером, до утра они нагреются.
Не забывайте о толщине кусочов для проводки - не более 3 мм и остальных правилах фиксации.
Также должен быть правильный парафин и микротом также не последнее место занимает в этом процессе.
Проверьте все еще раз, должно все хорошо получится.
|
| |
| |
| Pesikot | Дата: Среда, 2012-02-01, 11:09 PM | Сообщение # 278 |
|
Рядовой
Группа: Проверенные
Сообщений: 6
Статус: Offline
| Спасибо, Maxim. Конечно буду пробовать еще, заменю масло, потому что на термостате выставлена температура 60 и смеси несколько дней стоят. Причем первая смесь нормально смешалась. Не думаю, что проблема может быть с парафином или микротомом, скорее в руках ))).
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2012-02-02, 6:44 AM | Сообщение # 279 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Изначально температура 60оС наврное, многовата. Если есть возможность, то поставьте смеси и масло в отдельный термостат 50оС, если такой возможности нет, то хотя бы держите смеси на верхней полке и ближе к дверце: в маслянных термостатах типа ТС-80 здесь чуть-чуть прохладнее. Проверяйте температуру в банках, а не только на приборе. И не забывайте про смену реагентов.
Нахождение в нагретом состоянии длительное время реагентам не вредит. Масло держите без крышки, а смеси накрывайте железными крышками в евробанкх - пластикове плавятся.
Если работаете с тканями мышей и крыс в 60оС попробуйте даже уменьшить время в смесях при 60оС до 20 или даже до 15 минут, но хорошенько перемешивайте кассеты. Вобщем, пробуйте, ищите оптимум.
Но 60оС для грызунов не желательно!
|
| |
| |
| Karen | Дата: Четверг, 2012-02-02, 2:52 PM | Сообщение # 280 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Уважаемая Pesikot! Я думаю у Вас масло не то (возможно слишком густое, т.е. вязкое), я купил, по совету Максима, автомобильное масло И-20А (веретенное масло), и смесь его с изопропанолом (и 2:1 и 5:1) становится прозрачной при температуре 50 градусов (а может и ниже, не проверял). Ленты 3 микрона - без проблем.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2012-02-02, 8:00 PM | Сообщение # 281 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Karen!
Я получил ответ от моих друзей, которые имели дело с гистологией морских объектов.
К сожалению, они не имели дело с актиниями, но подтвердили, что это объекты с высоким содержанием воды и практически полным отсутствием жира (с каким мы привыкли иметь дело у человека и животных), поэтому актинии очень быстро обезвоживаются и им не требуется много времени для пропитывания. Поэтому, если в партии идут только актинии, смело сокрщайте свой протокол даже на 2/3 от времени человечексих тканей и результат должен быть вплоне приличный. А может быть, все будет и быстрее.
Попробуйте протокол для эндоскопийного материала (он есть где-то на предыдущих страницах этой темы).
|
| |
| |
| Pesikot | Дата: Пятница, 2012-02-03, 6:21 PM | Сообщение # 282 |
|
Рядовой
Группа: Проверенные
Сообщений: 6
Статус: Offline
| Quote (Karen) Я думаю у Вас масло не то (возможно слишком густое, т.е. вязкое), я купил, по совету Максима, автомобильное масло И-20А (веретенное масло), и смесь его с изопропанолом (и 2:1 и 5:1) становится прозрачной при температуре 50 градусов (а может и ниже, не проверял). Ленты 3 микрона - без проблем.
Да, я хочу заменить масло. Я использовала вазелиновое масло из Лабтеха, на нем не указана вязкость. Буду искать И-20А.
Maxim! У меня отдельный термостат, просто первая смесь ниже чем при 55С (на приборе, а в самой 54С) не расслаивается, вот я попробовала поднять температуру до 60, но все равно вторая смесь не хочет. Попробую со сменой масла. Смеси в банках с притертыми крышками. Спасибо за советы, буду пробовать!
Quote (Maxim) Этот протокол был разработан для хирургических образов тканей человека.
Если приходится иметь дело с тканями грызунов (мышей, крыс), кошек и собак, то время в ИПА можно сократить вдвое на каждой станции, а смеси по 1 часу.
Я не знала, что человеческие ткани отличаются в проводке от крысиных, мне казалось, что время зависит только от толщины кусочка и органа.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2012-02-03, 10:07 PM | Сообщение # 283 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемая Pesikot!
Я тоже попадал на разные виды минрерального масла и у меня были очень большие неудачи. К сожалению, такие вещи очень сильно отбивают охоту пользоваться минеральным маслом для проводки. Поэтому повнимательнее относитесь к продающим компаниям. Если есть такая возможность - просите на пробу образцы и все станет сразу понятно.
Идея уйти от избыточного нагрева происходит частично из иммуногистохимии (там важно сохранить антигены - часть из них разрушается от нагрева в проводке) и частью от микротомии (нагрев - это не панацея для пропитывания и диффузии разными реагентами).
Многие исследователи испытывают большие затруднения при работе с мышиными и крысиными тканями и причина здесь в одном - малом содержании воды.
Толщина кусочка - это геометрическое понятие и от нее в любом случае зависит скорость и качество диффузии реагентов. В конечном итоге, если кусочек толще 3 мм, то при обычном расписании проводки в 95% случаев вы получите гадкие микротомические характеристики.
|
| |
| |
| Karen | Дата: Суббота, 2012-02-04, 10:04 AM | Сообщение # 284 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 11
Статус: Offline
| Я пробую оптимизировать протокол для больших кусков, сейчас провел актинию, плотный цилиндр 14мм диаметром и 12 мм высотой:
ИПА в сумме около суток;
ИПА-масло 5:1 и 2:1 по 5 часов;
Масло - до утра;
Парафины - около суток.
Порезалось (3 микрон) нормально.
Сейчас хочу для таких больших кусков сократить ИПА и парафины вдвое, посмотреть что получится.
Максим, хотел спросить, есть ли признаки по которым можно будет отличить друг от друга эти две ситуации при резке, или картина проблем будет одинаковая:
1. Недостаточное обезвоживание в ИПА
2. Обезвоживание нормальное, но недостаточно пропиталось парафином (мало держали).
Сообщение отредактировал Karen - Суббота, 2012-02-04, 10:06 AM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Суббота, 2012-02-04, 10:22 AM | Сообщение # 285 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Карен!
Так как актиния не содержит жира, то процесс обезвоживания должен произойти без особых проблем.
Попробуйте сделать все 5 ИПА по 1 часу, промежуточные смеси по 1.5 часа, масло до утра и парафины по 2 часа. Если все бует ок, сокртите парафин до 1 часа. С актиниями не должно возникнуть таких проблем, как с тканями человека и грызунов.
Если обезвоживание будет недостаточным, то уже в масле актинии должны выглядеть молочно-белыми так предполагаю). Хорошо пропитанные в масле куски выглядят точно такими же "прозрачными" как в ксилоле. Если бы хоть раз имели дело с жировыми тканями или соскобами человека, то увидели совершенно прозрачный жир и черно-коричневый сосудистый рисунок через всю толщу кусочка.
пропитывание парафином недообезвоженных кусочков будет проблемным. В результате ткани будут тянуться за ножом и выглядеть мокрыми и рыхлыми. Если даже и удасться получить срезы, то под микросокопом будут везде заметны длинные продольные щели по ходу коллагеновых волокон, ядра клеток будут как бы отдельными.
Интересно будет узнать, как протокол будет выглядеть в оконочательном варианте.
|
| |
| |
|
|
