Вы вошли как Гость
Текущая дата: Воскресенье, 2024-05-05, 3:38 AM
|
Проводка и заливка
|
|
| ksentippa | Дата: Понедельник, 2012-04-02, 10:10 AM | Сообщение # 301 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Статус: Offline
| Спасибо огромное!! Попробую так! Значит у меня правильно закрадывались подозрения, что промежуточные стадии уж в случае глаз точно необходимы. А ещё снизить маринование в спиртах, учту! А в ксилолах держать подольше, это не "обжигает" ткани (такое поверие у нас в лабе:-)))? А по поводу перехода на не вонючие реактивы - это очень затруднительно, уж точно не в этом финансовом году:-( Разве что я из своего кармана попробовать куплю (надо будет, кстати). И бутанол закуплен, мы его между этанолами и ксилолами в проводке используем (вы не знаете, зачем?), а если его не использовать там, то что с ним делать, у меня его куча, если он чем-то хорош (на вонючесть пока забьём, лаборантов у меня нет, сама нюхаю), то чем, расскажите, пожалуйста?
И ещё маленький вопрос про "кашу": я размешиваю ксилол с парафином 1:1 и ставлю в термостат на 40* в закрытом бюксе, так? А как быстро ксилол да ещё в тепле испаряется? Как часто эту кашу надо менять? Или подливать ксилола? (количество глазюк у нас небольшое)
Простите неуча, а зачем дофиксировать срезы? Никогда не слышала:-( Что это дает и в каких случаях необходимо?
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2012-04-02, 11:36 AM | Сообщение # 302 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Бутанол - это почти такой же спирт, как и этанол. Если все, что выше я написал про этанол, заменить бутанолом и прибавить на каждомэтапе времени минут по 15-20 к тем, что имеются, то должна получиться подходящая проводка для таких трудных и сухих объектов как крысы и мыши. Я не уверен, что бутнанолом можно хорошо провести ткани, минуя этапы с ксилолом. Это просто нужно пробовать, но такая вероятность есть. Не думаю, что из-за своего гадкого запаха бутанол вдруг заменит изопропанол.
В народе, смесь из всех эти изопропнолов, бутанолов, пентанолов (каждого есть по несколько изомеров) является побочным продуктом при производстве этанола путем самогоноварения и называются сивухой, потому как на чисто белом фоне они дают легкий голубоватый (сивый) оттенок и соответствующий запах. В организме человека они расщепляются все теми же алкогольдегидрогеназами и альдегиддегидрогеназами, то есть симптомы отравлений аналогичны этанолу, только все это происходит гораздо дльше. Поэтому тяжелые спирты (бутиловый и амиловый) стараются не применять в гистологии.
Вентиляция при работе с такми вещами просто необходима.
Логика смены регаентов следующая: последий спирт должен быть свежий для каждой новой партии объектов. Например, для баночки в 300 мл смена будет нужна через 30-40 кассет. Промежуточные смеси менять вместе с ксилолом, то есть после проводки 60-80 кассет. Парафин заменить через 100-120 кассет. Последняя партия свежая, предыдущие передвигать на одну позицию влево, первую - утилизировать согласно принятым в лаборатории правилам.
Смесь ксилол:парафин лучше держать закрытой. Слишком много ксилола не испарится, но вонять будет сильно, если крышки не будет. Из парафина ксилол испаряется относительно плохо, но парафин лучше держжать окртытм. Спирты - закрытые.
В промежуточную смесь с парафином можно долить ксилол,если нужно.
Дофиксация во многих случаях исправляет недостатки фиксации. Поэтому в некоторых методах требуетя действие Буэна (метод Массона, Маллори и другие) или бихромата калия и уксусной кислоты (методы выявления миелина). Так делать правильнее, потому что если мы зафиксируем кусочки в фиксаторе Орта, например, то есть риск неадекватных результатов ИГХ при некоторых окрасках. Почти любой фиксатор хорошо для обзорной окраски Г-Э. Даже красивее картинка будет выглядеть при фиксации в Карнуа или смеси спирт-формлаин-уксусная кислота (прописей таких смесей великое множество). Если фиксатор не затрудняет последующую окраску в исследовательских работах, можно пользоваться тем, чем предпочитает исследователь.
Буэн дает более четкую морфологию ядерного хроматина и цитоплазматических гранул гемпоэтических тканей, чем формалин сам по себе.
|
| |
| |
| ksentippa | Дата: Понедельник, 2012-04-02, 1:57 PM | Сообщение # 303 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 5
Статус: Offline
| Спасибо большое!!!!!!
|
| |
| |
| Чакона | Дата: Четверг, 2012-04-05, 0:17 AM | Сообщение # 304 |
|
Полковник
Группа: Патоморфологи
Сообщений: 109
Статус: Offline
| Quote (Maxim) Я не уверен, что бутнанолом можно хорошо провести ткани, минуя этапы с ксилолом. Это просто нужно пробовать, но такая вероятность есть.
Можно.
|
| |
| |
| intheusa | Дата: Вторник, 2012-07-31, 9:10 AM | Сообщение # 305 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 2
Статус: Offline
| Здравствуйте! подскажите пожалуйста: можно ли использовать биовитрумский isoprep в батарее для окраски Г-Э, если да, то какой состав батареи должен быть? Купили на пробу 5 л. для проводки ОБМ по прописи от тогоже биовитрума.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Вторник, 2012-07-31, 11:01 PM | Сообщение # 306 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Уважаемый intheusa!
По идее Биовитрум должен быть снабдить вас детальными указаниями на счет применения своих реагнетов. Или же у них должна быть технологическая поддержка (где-то на их сайте есть телефоны и прочее).
От себя могу сказать, что теоретически к применению изопрепа в батарее для окраски гематокслин-эозин и ряде других гистохимических и ИГХ методов не должно быть. Вы можете спокойно использовать его как после ксилола в депарафинировании, так и перед ксилолом при обезвоживании и просветлении. Однако сам я не пробовал этот реактив.
Обычно для постоянно работы с большими партиями хорошо иметь три станции с ксилолом, затем 3-4 станции с дегидратантом (к этой группе относится изопреп), затем дистиллированная или деионизированная вода, красители с соответтвующими станциями промывки, дифференцировки и т.д., после: 3, а лучше 4 станции с дегидратантом и 2 ксилола. Причем станции для депарафинирования нельзя использовать для обезвоживания и просвтеления перед заключением и наоборот. В разных лабораториях эти батареи отличаются вследствие сложившихся исторических традиций в силу разных причин.
По моим подсчтам 5л должно хватить, чтобы ощутить действие реагента, но много партий вы не покрасите, хотя бы потому, что прийдется вливать новый реагент во все станции. При постоянном пользовании и замене уходит гораздо меньше реактива.
Работать в такой батарее можно с любым типом материалов, даже ИГХ и замороженными срезами (здесь пропускают первые позиции с ксилолом и пользуются изопрепом только на этапе обезвоживания).
Также советую Вам просмотреть в этом же форуме раздел "Окраска". Там мы много моментов уже обсудили ранее.
|
| |
| |
| intheusa | Дата: Четверг, 2012-08-09, 7:42 AM | Сообщение # 307 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 2
Статус: Offline
| Еще вопросик: кто пробовал "изопропанол плюс" от компании ПЛК (http://1plk.ru/prep/izopropanol-plus) скажите каковы результаты, сравнимы ли они с биовитрумовским "Изопрепом"? Дело в том , что в августе компания ПЛК продает свой реактив(изопропанол плюс" по 150 руб за литр, написал в ббиовитрум, мол какую скидку сделаете, они предложили по 160 руб за литр (изопреп), вот теперь думаю, что выбрать, помогите.
ps: к покупке планируем 500 литров пока)
Сообщение отредактировал intheusa - Четверг, 2012-08-09, 7:43 AM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2012-08-09, 9:59 PM | Сообщение # 308 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Судя по составу, обозначенному на этикетках и в спецификациях, оба дегидратанта (изопропанол плюс и изопреп) должны быть одинаковы.
Я пробовал другие продукты, содержащие изопропанол и тритон и не содержащие тритона и честно говоря не смог увидеть разницы. Да, может быть я не то смотерл и не туда (на память приходят люди с завязанными глазами, подходящие к слону с разных сторон - у них разные впечатления от одного и того же слона).
И кажется из этого можно извлечь одну пользу: при выходе в госзакупки больших объемов обезвоживающего агента можно не напрягаться в ожидании результата конкурса: будет тот же продукт, но с дешевой ценой и неважно, какая фирма его продаст в итоге.
Сезонные скидки мне вобще непонятны в гистологических реактивах. Зачем их делать в сезон? Что, в другое время в лаборатории ими не пользуются? Или у всех такое великое желание бегать по поставщикам за скидками в 10 р? Беготня на мой взгляд обойдется дороже. Покупайте у того, кто ближе, кому доверяете, у кого удобнее.
|
| |
| |
| mistermm | Дата: Четверг, 2012-09-06, 9:41 PM | Сообщение # 309 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 17
Статус: Offline
| Уважаемые коллеги!
Подскажите пожалуйста:
1) Можно ли при проводке куски оставлять на ночь в IsoPrep'е (имеется в виду - в какой-то одной смене)? В отделении ручная проводка с изопропанолом (без минерального масла!.) и сокращенный рабочий день - так что схему проф. Криволапова выдержать не получается, как и задержать материал в масле. Если можно, то, на ваш взгляд, сколько смен в аИП на следующее утро нужно провести как минимум и по сколько времени каждая смена - опять же минимальное время? Вы понимаете, к чему я клоню - чтобы успеть материал провести через парафины и залить в этот же день..
2) Также в схеме не упоминается предшествующий этап в виде 50%-го аИП, о котором иногда пишут. Почему? Он не обязателен - куски сразу после промывки в воде можно пускать в первую смену аИП? Или предполагалось, что это и так понятно? ))
3) Что делать в пятницу-субботу? В субботу материал никто заливать не будет. Как продолжение вопроса из п.1 - если материал 3 ночи пролежит в аИП? 
4) В случае ксилольной проводки - опять же проблема с выходными. Есть варианты - оставлять материал на 3 ночи в парафине (56 град.) или 1 ночь в ксилол-парафиновой каше и 2 ночи в парафине или 3 ночи в каше (56 град) или 3 ночи в каше, вынутой из термостата? Уффф...
Спасибо за внимание!
Сообщение отредактировал mistermm - Четверг, 2012-09-06, 9:45 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Четверг, 2012-09-06, 10:05 PM | Сообщение # 310 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Честно говоря, в методе с маслом и есть этот перерыв на ночь (выходные, каникулы и на любой нужный срок) в масле для того, чтобы ткани не повреждались.
Схема Ю.А. Криволапова выполнима для карусельных процессоров, но такой процессор нужен не один, чтобы загружать их через день. Я не думаю, что в каком-нибудь отделении при наличчии нескольких вакуумных процессоров была возможность выполнять рекомнедации по 37 часовой проводке. Поэтому, отходя от предложенной схемы и получаются всякие результаты, кроме рекомендуемого.
Никаким образом при сокращенном рабочем дне вы не сможете получить препараты в тот же день по несокльким причинам.
1. Фиксация вырезанного препарата не менее 24 часов. Время на процесс вырезки, подгтовку и уборку тоже нужно считать.
2. Если кусочки имеют толщину 1.5-2мм, их можно провести за несколько часов например в Leica Peloris, но у вас его нет. Это очень дорогое удовольствие.
3. Нужно время на заливку - это ручная процедура, охлаждение блоков, раскладку, микротомию, работу со стеклами перед окраской и после. Заключение, сушка и т.д.
Поэтому в вашем варианте нет другого выхода, кроме задержки до утра в последнем аИП (на выходных есть риск избыточного обезвоживвания богатых кровью или содержащих мало воды образцов; попробуйте и расскажете нам). На утро - парафины. До вечера блоки сделаете.
От ксилола в любом случае есть смысл отказаться. Не гробьте здоровье свое и окружающих. Поверьте, ксилол штука очень вредная и опасная.
Каша парафин-ксилол, вынутая из термостата, продолжит просветлять объекты, так что они также могут быть к утру ломкими и хрупкими. Утром понадобится еще пара-тройка часов времени на расплавление, а потом уже нужно пропитывать парафином.
В прямом методе проводки аИП-парафин самое проблемное место - избавление от аИП в парафине. Над этим ломают голову все, включая производителей процессоров. Ни один способ из предложенных не эффективен. Везде есть минусы и плюсы. Чем-то нужно жертвовать. Выберите свою жертву. И расскажите потом о вашем способе, который станет оптимальным.
|
| |
| |
| mistermm | Дата: Четверг, 2012-09-06, 10:56 PM | Сообщение # 311 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 17
Статус: Offline
| Спасибо за ответ! Я имел в виду под тем же днем - день после того, как куски ночь пробыли в изопропаноле.
Как я понял, этап в наполовину разбавленном водой аИП необязателен? Наши лаборанты будут в шоке от того, что куски сразу после формалина пойдут в абсолютный пусть и изопропиловый спирт )) Они привыкли их помещать сначала в отработанный спирт (тот, который по-хорошему уже сливать надо)...
Учитывая проблему избавления от аИП в парафине - логично, что парафинов должно быть как минимум 3? Никак не 2?
Пока в голове вырисовывается такая схема (для опер. материала):
1 день - Формалин I
2 день - перекладываем в Формалин II
3 день
1) промываем в водопроводной воде - 1 час
2) изопреп I - 1 час
3) изопреп II - 1 час
3) изопреп III - 2 часа
4) изопреп IV - 2 часа
5) изопреп V - на ночь
4 день
3 парафина по 1 часу (56 град.), примерно в 12:00 - заливка
На выходные материал остается в изопропаноле..
Сообщение отредактировал mistermm - Четверг, 2012-09-06, 11:21 PM |
| |
| |
| Maxim | Дата: Пятница, 2012-09-07, 8:46 PM | Сообщение # 312 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Да, верно, это один из компромиссных вариантов.
Я бы сделал 4 парафина по 1 часу. И обратил бы внимание на точку плавления парафина. Рекомендую тугоплавкие виды парафина, 58-60оС. Как минимум, в нашей лаборатории с ними получается резка лучше.
Рекомендую подумать еще над сменой реагентов. Без четкой логики грош цена всей задумке.
И не такой уж чистый этот первый изопреп в вашей батарее будет со временем. Поэтому шок можно отменить.
Дело в том, что для большинства образов не так уж и критично само понятие "обезвоживание", поскольку воды ткани содержат не так уж и много. Важнее удалить нейтральный жир. Именно с ним тяжелее всего воевать. В жировой ткани много мембран и именно через них тяжелее всего проникать реагентам. Изопропанол сам по себе не является отличным растворителем, жира, но двольно сносным. И поэтому даже хотя бы отчасти растворенный жир нужно удалить из ткани. В этом помогает пропитывание парафином. Поэтому этот этап должен быть четко продуман. 4 х 1 час вполне хорошо, особенно в постоянном потоке. Но не факт, что это будет идеально. Пробовать нужно.
|
| |
| |
| mistermm | Дата: Понедельник, 2012-09-10, 3:45 PM | Сообщение # 313 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 17
Статус: Offline
| Делюсь впечатлениями. Пока всё не очень. Сделали вот что. В субботу из второго формалина куски промыли, пустили в проводку: 50% аИП - 30 мин, аИП I и II по часу, в III-м оставили на 2 ночи. Сегодня утром подержали в IV и V по 30 мин. Затем 3 парафина по 1 часу при 56 град. Сели заливать - куски оказались мягкими (сравнительно), не пропитанными парафином в центральных отделах (беловатые в центре), резались плохо. Срезы на воде "крутились", из чего лаборанты сделали вывод, что в них осталась вода  Видимо, это тот самый жир... Куски обратно завязали и оставили в 3-м парафине до утра. Посмотрим, что будет.
Тут мне где-то попадались чьи-то слова, что кусочки у них вырезаются тонкие - 3 мм. У нас они явно толще - 5-6 мм. Может, толщина кусков принципиальна для проводки с изопропанолом?.
|
| |
| |
| Maxim | Дата: Понедельник, 2012-09-10, 8:55 PM | Сообщение # 314 |
|
Профессионал
Группа: Модераторы
Сообщений: 555
Статус: Offline
| Да, толщина - это самое главное. И не только для аИП, но и для любых других реагентов. Пока у вас не будут вырезаться куски толищной 3 мм, то никакой фиксации за 24 часа во всем кусочке не произодйет. Куски толщиной 5-6 мм будут требовать фиксации до 72 часов! А жиру и этого будет мало. Поэтому жир не должен быть толще 2 мм.
Когда срезы на воде крутятся - они содержат спирт. По мере замещения водой они перестают крутиться. Вот здесь и происходят разрывы межмолекулярных связей, если они плохо связаны формалином.
Жир не растворяется в парафине. Или он извлекатеся изопропанолом или замещается неполярными растворителями (ксилол, хлороформ, масло). Остатки жира и не дают возможности получить срез. Будет дырка вместо кусочка. А на блоке размазанный жир.
В вашем случае ткани не пропитались парафином по двум причиам. 1. Недостаточная фиксация (об этом свидетельствуют беловатые участки в центре образца). 2. Неадекватное вытеснение аИП парафином. Это не происходит опять же из-за недостаточной фиксации. Вряд ли проблема будет разрешена пролонгированным действием парафина.
Я бы расплавил парафин, в горячем состоянии промокнул бы несколько раз избыток парафина, а затем бы снова поместил ткани в фиксатор на 2-3 суток и в каждом аИП, минуя 50% и 70% продержал бы по 5-6 часов, в последнем ночь. Далее 4 парафина по 2-3 часа, последний до утра.
Конечно, нет гарантии после этого для получения качественных результатов ИГХ, но струкутру, возможно, удасться спасти. Это вариант спасения, а не рутины. Именно такой нетипичный способ должен быть эффективен. Я и другие люди пользовались этим способом не однажды. Если сделаете - нам тоже будет интересен результат. Или ваш способ и результат тоже.
И еще совет: купите касеты. В них нельзя впихнуть кусочки толще 3 мм.
|
| |
| |
| mistermm | Дата: Понедельник, 2012-09-10, 10:12 PM | Сообщение # 315 |
|
Рядовой
Группа: Пользователи
Сообщений: 17
Статус: Offline
| Спасибо за столь подробный ответ и за советы! Не совсем, правда, понятна эта фраза "Я бы расплавил парафин, в горячем состоянии промокнул бы несколько раз избыток парафина" - т.е. расплавить куски с блоков в парафине, промокнуть и сразу же снова поместить в формалин (вы пишете - в фиксатор)?
|
| |
| |
|
|
